关于《山东省临床检验实验室血培养操作指南》

山东省临床检验实验室血培养操作指南（试行）二〇一一年五月三十日目录1.标本的采集和运送1.1总体要求1.1.1血培养的临床指征1.1.2血培养的采集时机1.1.3血培养的次数1.1.4血培养的采血量1.1.5血液标本在需氧瓶和厌氧瓶中的分配1.2血培养标本的采集1.2.1皮肤消毒与防止血培养污染1.2.2标本采集部位1.2.3减少血培养污染的注意事项1.3血培养标本的运送1.4血培养标本的拒收标准1.5培养瓶的选择1.6血培养的培养周期2.几种特殊要求的血培养2.1分枝杆菌血培养2.2婴幼儿血培养2.3导管相关的血流感染（CRBSI）2.3.1短期外周导管2.3.2中心静脉导管及静脉留置口（VAP）2.4感染性细菌性心内膜炎2.4.1血培养的采集时机2.4.2需要的血培养数量2.4.3需要的培养瓶2.4.4血培养所需孵育时间3.血培养结果的报告方式3.1阳性血培养的分级报告制度3.1.1初步报告3.1.2二级报告3.1.3最终（书面）报告3.2其他报告和记录4.血培养的污染问题及其鉴别5.血培养的质量控制5.1血培养分析前质量控制5.1.1病人评估5.1.2血培养标准操作规程(SOP)的制定和培训5.1.3样本采集5.1.4样本运送5.1.5样本接收和处理5.2血培养分析中质量控制5.3血培养分析后的质量控制5.3.1报告5.3.2记录管理5.3.3咨询参考文献当微生物侵入血液迅速繁殖超出机体免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血症或真菌血症（统称血流感染），并可感染血管外组织,临床上应该进行急症处理,应尽快采集血液进行培养。资料显示，菌血症或真菌血症发病率近10年来持续增加，2007年美国共报告菌血症发生66万例[1]，在各种感染中居首位，且死亡率高（20%~50%）。血培养是采集患者血液标本并接种到培养瓶中，用以发现、识别引起菌血症或真菌血症的病原微生物，是诊断菌血症和真菌血症的基本而重要的方法。血培养结果对感染性疾病的诊断、治疗和预后都有极为重要的临床意义。1.标本的采集和运送1.1总体要求1.1.1血培养的临床指征：患者出现以下一种或同时具备几种临床表现时可作为血培养的重要指征：①发热（≥38℃）或低温（≤36℃），以间歇驰张型多见，革兰阴性杆菌，如大肠埃希菌引起的感染可见双峰热；②寒战；③白细胞增多（10.0×109/L，特别是有“核左移”时）；④粒细胞减少（1.0×109/L）；⑤血小板减少；⑥皮肤、黏膜出血，常见于溶血性链球菌感染的菌血症，伤寒病人第4~10天可出现玫瑰疹，斑疹伤寒第4~6天可出现暗红色斑丘血疹；⑦昏迷；⑧多器官衰竭；⑨血压降低；⑩呼吸加快（呼吸率20/分或CO2分压32mmHg）；以及肝脾肿大；关节疼痛；C反应蛋白、内毒素、降钙素原升高等。对新生儿可疑菌血症,还应同时做尿液和脑脊液培养。老年菌血症患者可能不发热或体温不低，如伴有身体不适、肌痛或卒中，可能是感染性心内膜炎的重要指征。1.1.2血培养的标本采集时机：只要怀疑患者有血流感染的可能，在考虑使用抗菌药物之前，都应立即采集血培养标本。若患者已行抗菌药物治疗，则应选择含有抗菌药物吸附物的培养瓶，并在下一次抗菌药物应用前采血培养。细菌通常在寒战和发烧前1小时入血，此时为采集血培养标本进行病原菌培养的最佳时机。1.1.3血培养的次数：要求：对怀疑菌血症、真菌血症的成人患者，推荐同时或短时间间隔（10分钟内）从不同部位（如双臂）采集2～3套血培养标本，做到“双瓶双侧”。如有必要，可同时或短时间间隔内从下肢静脉采血接种第三套培养瓶。在采集血培养后的2至5天内，不需要重复采集血培养只有在疑似感染性心内膜炎或导管相关性感染患者的连续性菌血症时在不同时间点采血才有必要。婴幼儿患者，需要同时采集2次(不同部位)血培养标本。说明：以一个需氧瓶和一个厌氧瓶为一套血培养，作为常规血培养组合。所谓“双瓶双侧”，是指从一个部位采血接种一套培养瓶，再从另一部位采血接种另一套培养瓶。一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单个血培养[2]研究表明[3]，只做1套血培养，病原菌的检出率仅为65%，两套血培养为80%，三套血培养为96%。单瓶或单套血培养不仅检出率不高，而且难以区分污染导致的假阳性，结果很难做出临床解释，应该坚决予以废除。在抗菌药物治疗开始后的2至5天内，血液中的细菌不会立即清除。一般菌血症或真菌血症的患者可通过临床表现来判断疗效，无需复查血培养或者连续监测血培养。但有两个例外：一是细菌性心内膜炎患者，对于其菌血症或真菌血症是否被清除，连续血培养可被用于评估和指导治疗；二是与感染性心内膜炎无关的金黄色葡萄球菌血症，对其阳性血培养的48至96小时追踪可以很好地预测复杂的金黄色葡萄球菌血症[5]。1.1.4血培养的采血量：要求：成年患者推荐的采血量为20~30ml,每套不少于10ml，每瓶不少于5ml。婴幼儿患者推荐的采血量应少于患儿总血容量的1%，每瓶不少于2ml。对于采用成品血培养瓶的实验室，必须按照血培养瓶生产厂家的建议，采集足够的血液标本。说明：血培养采血量是影响病原菌检出率的最重要的可变因素[3，4，6，7]。一般情况下，成人菌血症患者外周血中细菌浓度为1~10CFU/ml，成人血培养采血量在2～30ml之间时，病原菌检出率与采血量成正比例增长[3，4，7]。儿童患者同样有数据表明检出率与血培养的采血量成正相关[8]，但由于儿童患者血液中病原菌浓度较高，一般约为成人血流感染病原菌浓度的10倍，血培养标本量无需等同于成人。但是，儿童也可能发生低水平的菌血症，血培养采血量要根据患儿的血容量和年龄确定。1.1.5血液标本在需氧瓶和厌氧瓶中的分配要求：以一个需氧瓶和一个厌氧瓶为一套血培养，作为常规血培养的组合。当采血量不够推荐的采血量时，应首先满足需氧瓶，剩余标本再接种入厌氧瓶。说明：采用一个需氧瓶和一个厌氧瓶的血培养组合与采用2个需氧瓶的组合相比，可检出更多的葡萄球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌[9]。真菌和严格的需氧菌（如假单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌）几乎全部只能从需氧瓶中分离到。1.2血培养标本的采集1.2.1皮肤消毒与防止血培养污染要求：使用碘伏、碘酊、次氯酸或洗必泰作为血培养的皮肤消毒剂，碘酊的作用时间不能少于30秒，碘伏的作用时间则需要1.5～2分钟。说明：碘酊与洗必泰的效果大体相当。洗必泰的作用时间和碘酊一样，但是没有过敏反应，因此在静脉穿刺完成后不必擦去，但不能用于小于2个月的婴儿皮肤的消毒。对年龄小于2个月的新生儿，需使用70%的异丙基乙醇进行皮肤消毒。消毒剂需要有足够的作用时间以保证消毒效果。1.2.2标本采集部位要求：从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。说明：不建议采集动脉血，其诊断价值不高，且增加了抽血污染的机会。尽量避免从静脉留置导管采血培养，因其常伴有高污染率［10，11，12]。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读（参见3.4导管相关血流感染）。1.2.3减少血培养污染的注意事项要求：采血之前，血培养瓶的橡皮塞需使用70%异丙醇酒精消毒并干燥，然后再进行穿刺部位的皮肤消毒。严格按照1.2.1所述皮肤消毒方法操作，并等待足够消毒时间。严格无菌操作，不允许在皮肤消毒后用手接触待穿刺部位，除非带有无菌手套。不推荐采血后更换注射器针头接种血培养瓶，采用真空采血装置能降低污染率。说明：无论采用何种采血方法，血培养可接受的污染率通常是≤3%［13]。研究表明，经过专门培训的熟练抽血者采集血培养的污染率为3%，而未经培训的住院医生和护士污染率则达11%。因此对临床护士就血培养标本采集进行专门的、严格的培训是非常必要的。1.3血培养标本的运送要求：采血后应该立即送检。如不能立即送检，需室温保存，切勿冷藏。标本接种到培养瓶后,需轻轻颠倒混匀以防血液凝固。说明：血培养瓶在接种前、接种后均不得冷藏或冷冻，否则会导致某些病原微生物死亡。接种后的培养瓶最好立即送到实验室，最迟不能超过2小时。自动化连续监测系统虽有允许延迟上机监测微生物生长的原理,还是应该尽量减少延迟上机时间，否则可能导致检测时间延长甚至假阴性结果。1.4血培养标本的拒收标准、遇到下列血培养标本应拒收并且要求重新采集标本：1.血培养瓶上贴的标签错误或未贴标签。2.血培养瓶渗漏、破裂或明显污染。3.血液凝固。1.5培养基的选择推荐使用商品化的血培养瓶。说明：使用添加抗菌药物吸附剂(如树脂或活性碳颗粒)的血培养瓶有助于提高已接受抗菌药物治疗患者血培养的检出率，特别是能提高葡萄球菌和真菌的检出率[14]，但同时也会增加污染菌的检出。1.6血培养的培养周期要求：传统手工血培养方法一般孵育7天。自动化血培养系统的标准血培养周期为5天。5天后阴性血培养标本无需常规进行转种。说明：自动化血培养系统的标准血培养周期为5天，包括布鲁杆菌、流感嗜血杆菌、放线杆菌、心杆菌、侵蚀艾肯菌、金杆菌以及营养变异链球菌等的培养周期都是5天［15]。对怀疑为感染性心内膜炎患者的血培养也不必延长培养时间。有研究表明，自动化血培养系统一般能在3~4天内检出95%~97%的有临床价值的细菌和真菌，但目前仍然推荐5天的培养周期。特殊情况可适当延长培养时间。2.几种特殊要求的血培养2.1分枝杆菌血培养要求：必须用特殊的商品化分枝杆菌血培养瓶。所有培养都必须孵育至少4周。培养温度为25~30℃。说明：虽然分枝杆菌并不需要特别复杂营养的微生物，但是为了更好地从血标本中分离出分枝杆菌，需要在肉汤培养基中补充脂肪酸（如油酸）、白蛋白和二氧化碳。一些分枝杆菌菌种（如日内瓦分枝杆菌、嗜血分枝杆菌）还需要分枝菌素、血红素、血红蛋白或枸橼酸铁铵这样的添加剂。快速生长的分枝杆菌（如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、产粘液分枝杆菌等）所致菌血症则大多与长时间留置静脉导管污染有关[16]。2.2导管相关的血流感染（CRBSI）据估计，美国每年发生超过25万例的CRBSI，病死率达12~25%。目前国内还没有相关的统计资料，但随着长期留置导管患者人数激增，CRBSI会越来越严重。CRBSI发生的危险因素包括：导管类型（中心静脉导管，外周导管）、导管放置时间及部位。虽然CRBSI发生比较频繁，但目前还缺乏诊断CRBSI的金标准，诊断往往比较困难。临床上在留置导管部位常常没有炎症表现，只有一些非特异的临床症状提示可能存在菌血症。临床微生物实验室有一些诊断此类感染的方法，比如导管片段的定量、半定量培养；经外周静脉采血和经导管采血培养结果比对；经外周静脉采血和经导管采血定量培养，比较经外周静脉采血和经导管采血培养阳性报警时间的差异等[18]，但还没有明确的结论表明哪种方法最好。为避免不必要的导管拆除，可以尝试导管保留在原位的CRBSI诊断方法。正确地区分CRBSI与皮肤污染、微生物仅在导管上定植以及其他来源感染有重大临床价值。2.3.1短期外周导管要求：通过静脉穿刺获得病人的两套外周血培养（双瓶双侧）。无菌操作拔出导管并用Maki半定量方法[19]培养。说明：Maki半定量法是先用75%酒精清洁导管周围皮肤，然后无菌移动导管，剪取导管末端5cm置于无菌容器中，立即送至实验室（为防止干燥，常规培养送检时间不得超过15min，4℃保存不得超过2小时）。实验室人员用无菌镊子将导管在血琼脂平板上交叉滚动4次，然后弃之，将接种后的培养基置CO2孵箱35℃过夜培养，平板上菌落数不少于15个为阳性。培养结果的解释：a如果一套或多套血培养阳性，导管片段培养也是阳性（半定量≥15个菌落），并且为同一种菌：提示导管相关血流感染（CRBSI）。b如果一套或多套血培养阳性，而导管片段培养阴性：不能确定为CRBSI；但如果培养出的是金黄色葡萄球菌或假丝酵母菌，而且能排除其他来源的感染，则提示CRBSI。c如果血培养阴性，而导管片段培养阳性，提示是微生物在导管表面定植而非CRBSI。d如果血培养阴性，导管片段培养也是阴性，则不可能是CRBSI。2.3.2中心静脉导管及静脉留置口（VAP