具有多靶标作用GSK-3抑制剂的设计与活性研究

具有多靶标作用GSK-3抑制剂的设计与活性研究王悦、刘伶、张文婷、姚建武，张丽娜，姜凤超*华中科技大学同济医学院药学院，武汉（430030）摘要：目的：设计合成对β-分泌酶和GSK-3均有抑制作用的化合物,验证利用药效图模型设计多靶点作用药物的可行性，设计活性强、副作用小的作用于AD的药物。方法:在数据库中利用相应的药效图模型寻找具有活性的母体结构，并进行相应的结构修饰，合成设计的化合物并进行相关的活性测定。结论：设计的化合物对β-分泌酶和GSK-3等靶点均具有一定的抑制作用。关键词：药效团模型；β-分泌酶抑制剂；GSK-3抑制剂；多靶点作用药物鉴于早老性痴呆（AD）具有病程长、病因多、发病机制复杂的特点,设想如果能够对AD的形成过程中的多个步骤进行控制，将更具有潜在的治疗价值。由Aβ聚集形成的老年斑及tau蛋白过度磷酸化引起的神经元纤维缠结处于AD产生的早期阶段。因此抑制Aβ的产生及tau蛋白过度磷酸化能从根本上阻断AD的发生，是目前研究的热点课题。目前,针对老年斑主要成分Aβ的清除,对β-分泌酶、γ-分泌酶的抑制是主要靶点[1];减少tau蛋白过度磷酸化,GSK-3抑制剂是研究热点[2]。然而,单独对其中一种酶进行抑制,经常会同时影响该酶的其它底物,具有较大的不良反应。设想设计合成对两个靶点同时作用的抑制剂,在实际应用中可减少使用剂量,从而得到具有高效低毒的化合物。按照药效团模型的概念，化合物如果能够符合药效团模型，就有可能具有相应的药理活性。以此类推如果该化合物同时符合两个以上的药效团模型，则有可能同时作用于两个以上的靶点，从而提高化合物的生物利用度，增强药理活性，降低毒副作用。以多种已报道的具有较好生物活性的GSK-3抑制剂为训练集建立药效团模型。在此模型及已建立的γ-分泌酶抑制剂药效团模型的基础上,对本实验室已设计合成的β-分泌酶抑制剂进行结构修饰,以期得到对GSK-3及β-分泌酶均具有较好抑制活性的结构新颖的先导化合物。采用合适的方法对所设计的化合物进行合成并分析,纯度较高的化合物进行GSK-3抑制及γ-分泌酶抑制的药理实验。将药理实验结果返回计算机辅助药物设计系统,验证药效团模型及设计的结果,为化合物的进一步筛选和改造打下基础。1、多靶点作用抑制剂的设计与合成1.1目标化合物的设计根据β-分泌酶抑制剂的药效团模型，在MDDR数据库中搜索出系列符合药效团模型的化合物，并对其中的化合物进行修饰和虚拟筛选；同时结合GSK-3抑制剂的药效团模型[3]和GSK-3具有两大对称亚基的结构特征设计出一类结构对称的化合物,含芳香环来增加环芳香性,环上不同部位含取代基改善化合物的亲水/疏水性。设计出的化合物结构如下(图1)，叠合结果见图2:NOONOOOORR图1所设计的化合物的结构1.2目标化合物活性的虚拟预测与类药性分析设计的化合物利用β-分泌酶抑制剂和1cR=H2cR=o-CH33cR=m-CH34cR=p-CH35cR=m-Cl6cR=p-Cl7cR=o-OCH38cR=p-OCH39cR=m-NO2GSK-3抑制剂的药效团模型进行虚拟活性预测和类药性分析。结果显示，设计的化合物对相应的靶点均具有一定的活性，其中对β-分泌酶的预测活性在nmol/L级别，对GSK-3的预测活性在μmol/L级别。同时化合物距符合利平斯规则[4]，并且预测的极化表面积TPSA值为93.22，与90接近，说明化合物可以通过血脑屏障。1.3合成根据目标分子的对称结构的特点，利用双向合成（two-directionalsynthesis）法，以丁二酰基为对称中心，向两边进行双向合成（图2）：HOOHOOSOCl2ZnCl2ClClOONH2RClOOCH3CHOH,CH3COONaHNOROClClOOCHCl3NOONOOOORR图2目标化合物的合成路线2、实验过程熔点由X-5型显微熔点测定仪测定，温度未校正。UV：紫外光谱仪：756PCSpectrum(上海光谱仪器有限公司)；IR：SpectrumOne傅立叶红外光谱仪测定。1H-NMR，13C-NMR：均采用ParianMercuryVX-300型核磁共振仪。2.1.丁二酰氯的合成在装有回流冷凝管和HCl接收装置的的500ml的三颈瓶中依次加入丁二酸118g(1mol),无水氯化锌27.2g(0.2mol),氯化亚砜350ml(4.8mol),搅拌下加热回流反应10小时，反应完成后,搅拌下冷却至室温,得到灰黑色混悬液。水泵减压蒸馏。水泵表压为-0.082MPa,收取122-124℃馏分，得无色液体80.6g,收率为52%。2.2中间产物N-取代苯基甘氨酸乙酯的合成[5]以N-苯基甘氨酸乙酯(1b)的合成[40,41]为例：向100ml三颈瓶中依次加入苯胺18.2ml(0.2mol),氯乙酸乙酯21.4ml(0.2mol),无水乙酸钠16.4g(0.2mol)和无水乙醇10ml,搅拌均匀。反应瓶中为白色混悬液。加热回流反应8小时后，得浅黄混悬液。搅拌冷却至室温后，缓慢向反应瓶中加入30ml蒸馏水,固体全溶,继续搅拌,有棕红色固体产生。抽滤,滤饼水洗两次。用乙醇重结晶。真空干燥。得有金属光泽的白色片状结晶30.9g,产率为86.3%,mp55-57℃(文献值53-56℃[40])。IR(KBr,σ/cm-1)：3386.28(υN-H),1517.91(δN-H);1731.87(υC=O),1222.83,1025.74(υC-O);1324.99(υAr-N);3049.28(υAr-H),1607.07,1583.65(υC=C),750.17(δAr-H),698.31(δC=C);2979.58(υasC-H),2902.73(υsC-H)。2.3.终产物二（N-取代苯基-N-乙氧羰甲基）丁二酰二胺衍生物的合成2.3.1以二(N-苯基-N-乙氧羰甲基)丁二酰二胺(1c)的合成为例：向100ml三颈瓶依次中加入3g(0.0168mol)N-苯基甘氨酸乙酯,氯仿20ml,搅拌后反应液澄清无色。滴加1.1ml(0.01mol)丁二酰氯和10ml氯仿的混合液。30min滴加完毕。再继续搅拌3小时。向反应液中加碳酸氢钠饱和溶液调PH至6。分液,取下层有机层。有机层加水10ml,分液,取有机层。用无水硫酸镁干燥。抽滤。滤液减压蒸氯仿，得少量浅黄油状液。向其中加入5ml无水乙醚,放置有固体析出。过滤,滤饼用乙醇重结晶。真空干燥得1.7g白色固体。产率39%，mp91-92℃。IR(KBr,σ/cm-1)：1731.87(υC=O),1200.75,1023.89(υC-O);1661.18(υC=O);1293.93(υAr-N);3070.07(υAr-H),1595.75,1495.71,1452.06(υC=C),782.06(δAr-H),702.17(δC=C);2988.11(υasC-H),2935.00(υsC-H)。1H-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：7.270-7.410(10H，m,H1-5),4.324(4H，m,H7),4.168(4H,m,H8),2.423(4H,t,H6),1.241(6H,m,H9)。13C-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)172.528（C8），169.485（C10），142.773（C1），130.010（C3，5），128.524(C4),128.452(C2,6),61.383(C11),51.577(C7),29.503(C8),14.342(C12)。其他化合物的合成基本同前。2.3.2二(N-邻甲基苯基-N-乙氧羰甲基)丁二酰二胺(2c)白色固体。产率41%，mp91-92℃。IR(KBr,σ/cm-1)：1752.32(υC=O),1198.52,1025.36(υC-O);1660.05(υC=O);1293.96(υAr-N);1492.03,1386.36(υC=C),780.91(δAr-H),731.40(δC=C)。1H-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：7.190-7.427(8H,m,H2-5),4.763(2H,d,H7),3.653(2H,d,H7’),4.160(4H,m,H8),2.382(6H,m,2-CH3),2.312(4H,m,H6),1.227(6H,m,H9)。13C-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：172.650(C7),169.370,169.255(C10),127.476-141.237(C1-6),61.326(C11),50.544,50.285(C9),29.188(C8),17.924,17.810(2-CH3),14.335(C12)。2.3.3二(N-间甲基苯基-N-乙氧羰甲基)丁二酰二胺(3c)白色固体。产率23%，mp94-97℃。IR(KBr,σ/cm-1)：1736.15(υC=O);1326.08,1024.26(υC-O);1661.84(υC=O);1605.10,1587.95,1491.64(υC=C),797.45(δAr-H),703.97(δC=C)。1H-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：7.135-7.295(8H,m,H2,3,4,5),4.299(4H,m,H7),4.169(4H,m,H8),2.431(4H,m,3-CH3),2.369(4H,m,H6),1.241(6H,m,H9)。13C-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：172.586（C7），169.528（C10），142.694（C1），140.074（C3），129.744(C5),129.285(C4),128.876(C2),125.365(C6),61.340(C11),51.606(C9),29.503(C8),21.492(2-CH3),14.342(C12)。2.3.4二(N-对甲基苯基-N-乙氧羰甲基)丁二酰二胺(4c)浅黄色固体。产率55%，mp119-120℃。IR(KBr,σ/cm-1)：1743.44(υC=O);1195.88,1032.01(υC-O);1657.01(υC-O);1386.47(υAr-N);1512.65,1420.81(υC=C),802.12808.25(δAr-H),724.12(δC=C)。1H-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：7.154-7.268(8H,m,H1,2),4.298(4H,m,H7),4.160(4H,m,H8),2.410(4H,m,3-CH3),2.356(6H,m,H6),1.235(6H,m,H9)。13C-NMR(300MHz,CDCl3,δppm)：172.722（C7），169.549（C10），140.175（C1），138.459（C4），130.577(C3,5),128.151(C2,6),61.326(C11),51.585(C9),29.489(C8),21.306(2-CH3),14.342(C12)。2.3.5二(N-间氯苯基-N-乙氧羰甲基)丁二酰二胺(5c)白色晶体。产率37%，mp106-108℃。IR(KBr,σ/cm-1):1740.16(υC=O);1207.16,1022.44(υC-O);1658.44(υC-O);1377.08(υAr-N);1591.85,1575.40,1476.92,1419.63(υC=C),792.95(δAr-H),697.79(δC=C);1H-NMR(300MHz,CDCl3,δppm):7.270-7.419(8H,m,H1,3,4,5),4.302(4H,m,H7),4.199(4H,m,H8),2.429(4H,m,H6),1.258(4H,m,H9);13C-NMR(300MHz,CDCl3,δppm):172.155（C7），169.233（C10），143.814（C1），135.379（C3），131.00