农残培训讲义

培训讲义第一部分蔬菜农药残留的提取一.分析样品的提取1.分析样品的分类分析样品是指实验室中，用于分析测定并提供某种样品残留数据的那一部分样品。所以分析的样品要求必须是均匀且具有代表性的。在处理比较陌生的样品，尽可能参考相关文献报道的方法制备，这样可以减少许多困扰。由于样品中的物质和结构的差异，使的样品的提取，尤其是浓缩提取的净化。一般将样品分为三类：1.1中等和高含水量的样品：1.1.1根和鳞茎类蔬菜：胡萝卜、洋葱1.1.2夜绿素含量最底的蔬菜和水果：仁果、核果、浆果和柑橘1.1.3叶绿素含量高的作物：叶菜和豆菜1.2干燥品1.3油脂类2.农药残留条件的选择提取就是将残留在样品中的多种农药，采用合适的有机溶剂和方法，将其分离出来，以供净化后测定，这是农药分析非常关键的一步。提取效果的好坏，一方面决定于溶剂的选择，另一方面和提取的方法也有密切的关系。在选择提取溶剂时，既要注意到溶剂本身的性质，又要结合农药的特性及样品的状况，在选用提取方法时也要考虑上述情况。1.溶剂的选择：在农药分析中几乎不单独采用非极性溶剂，通常是与极性溶剂混合使用或只采用极性溶剂。主要溶剂的极性强弱如下：水乙腈甲醇醋酸乙醇乙丙醇丙酮二恶烷四氢呋喃甲基乙基甲酮苯酚正丁醇乙酸乙酯乙醚硝基甲烷二氯甲烷氯仿苯甲苯二甲苯四氯化碳二硫化碳＞环己烷正己烷正庚烷煤油在农药分析中应用最广的溶剂为石油醚、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯等2.农药的极性：在提取样品中的农药残留时，农药本身的极性以及在提取溶剂中的溶解度，直接影响提取效果，一般采用和农药极性相仿的提取溶剂，即“相似相溶”原理，选择具有广泛覆盖面的溶剂作为农残提取溶剂。部分有机磷的极性强弱如下：氧化乐果敌百虫敌敌畏马拉流磷倍硫磷甲基对硫磷对硫磷甲拌磷溴硫磷辛硫磷3.样品的状况：样品的特点和状态，在提取时也必须认真考虑。在AOAC中将样品分为脂肪性和非脂肪性两大类。脂肪含量大于10%为脂肪样品，小于则为非脂肪性样品。#脂肪性大的样品，需要先提取脂肪，而后测定脂肪中的农药残留量。非脂肪性的样品又分为含水样品和干品两大类；前者的水分含量≥75%，后者为干的或低水分样品。含水分样品又分含糖多少分类：含糖5%以下，含糖15~30%等几种.如下表示:状态脂肪非脂肪干品含水样品低糖中糖高糖不同现状的样品,必须采用不同的提取溶剂。在谷物、茶叶一类水分低的样品中，不同提取溶剂的提取效率的差异最为突出，即便采样极性溶剂也不能完全提取，必须采用含水20~40%的溶剂或预先向试样中加入等量的水之后再行提取。土壤是个比较特殊的样品，是农药污染最大的受害者，许多农药较强的与土壤耦合，比动植物组织的提取更困难。土壤的水分、有机质、极性化合物以及其他因素的不同对农药的结合也不同，一般粘土高沙土低。3．农药残留的提取和纯化（净化）在农药残留分析中，提取溶剂必须适用于具有不同含量的水分、油脂、糖分和物质的基质中，提取出具有各种极性的化合物。为了提供合适的条件，使残留物从样品中转移到提取溶液中。例如土壤、粮食等干燥样品彩一种或多种混合溶剂浸泡，经震荡或索氏提取；中、高含水量的样品，需在高速捣碎机中，在一种或混合溶剂的存在下加以粉碎。在通常情况下，蔬菜和水果用匀浆机或组织捣碎机提取。1初步提取溶剂的体系1.1丙酮提取法：用于含多糖类样品中农药的提取，再用二氯甲烷经液-液分配转入二氯甲烷中。在有机磷和有机氮多残留分析中已经广泛使用。1.2乙腈提取法：适用于一些农药，但若是水溶的农药时，采用二氯甲烷进行液-液分配。1.3丙酮-正已烷混剂：用于非极性化合物，极性有机磷和有机氮农药及其性代谢产物。此外，也有报道采用乙腈-二氯甲烷、乙腈-氯仿、丙酮-二氯甲烷、丙酮-石油醚。对于谷物、秸秤、茶、土壤等干燥样品，添加一倍水量后或用含水溶液提取，提取率比直接用极性溶剂要高得多。2初步提取液的纯化（净化）2.1液-液分配净化法：液-液分配是一种常用的净化方法，基本原理是分配规律，根据农药与杂质在不同溶剂中溶解度的差别，常用一种非极性溶剂和极性溶剂对来进行分配，如：丙酮-已烷、乙腈-乙烷（石油醚）、丙酮-二氯甲烷、二甲基甲酰胺-已烷等。农药与脂肪、蜡质、色素等一起被正已烷提取后，再用一种极性溶剂，如乙腈与共同震摇，使农药与脂肪、蜡质、色素完全分开。这样农药大部分被乙腈所提取，经几次提取，农药几乎可以完全与脂肪等杂质分离，从而达到净化的目的。2.2弗罗里硅土柱层析方法：弗罗里硅土柱层析净化方法在农药残留分析中已有广泛应用，而在多残留分析中常用极性不同的溶剂体系，把各种农药淋洗入不同的洗提馏分中，使农药得到分组分离。MILLS等提出的淋洗体系为A、B、C3种极性依次增大的体系：A液：二氯甲烷：正已烷（1：4）B液：二氯甲烷：乙腈：正已烷（50：0.35：49.65）、C液：二氯甲烷：乙腈：正已烷（50：1.5：48.5）THEIR的用石油醚：二氯甲烷（4：1）石油醚：二氯甲烷（3：3）二氯甲烷：甲醇（19：1）的淋洗体系，分离水果和蔬菜中的一些磷酸酯、有机氯、甲基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯和脲类农药。黄士忠等研究采用二氯甲烷：石油醚：丙酮（6：：3：1）预淋及二氯甲烷：石油醚：丙酮（6：3.5：0.5）淋洗，分离了土壤和粮食中10种有机氮，回收率81~103%。4．农药残留的提取操作方法1.震荡法：将样品和溶剂装入具塞容器（具塞锥形瓶），放在震荡机上，进行往返震荡或旋转震荡。定时开塞放气。2.组织捣碎提取，将样品和溶剂装入组织捣碎机中，通过高速旋转的刀具掺合，使溶剂侵入样品组织中，与其残留农药充分接触，使残留农药提取出来。本法提取效率高。适用范围广，每次提取时间3~5分钟，提取次数1~2次。3.索氏提取法:将样品装入和提取器匹配的滤纸包好，然后用合适的溶剂反复提取。回流液一定要浸泡整个试样。本方法适用于干品，如谷物、干果、脱水蔬菜、茶叶、干饲料等。4.消化法：酸、碱消化法，条件是农药在酸、碱中稳定。5.其它方法：超志声波法、浸渍法、洗脱法等等5．农药残留的净化技术在样品的提取液中，除了农药残留外，还有色素、油脂或其他天然物质，在测定前须去除这些干扰物质，这就是净化。由于农药种类不同，采用的检测器也不同。各种检测器对净化液程度的要求也不互相间。ECD放射源易受污染，对净化要求高，FPD对净化要求不高，采用简单的方法净化就可以了。液-液分配：在一组织不相溶的溶剂对中，溶解某一溶质成分，这种溶质以一定比例分配在溶剂的两相中。在两相溶剂中的分配比称为分配系数。如此反复分配，便可使不同的物质组分得到分离，从而达到净化的目的。分配时溶剂体积及提取次数，必须根据P值进行计算。P值指在一组等容积互不相溶的溶剂对，溶质以一定比例分配在溶剂的两相中，该比值即为该物质对该组溶剂的P值。1乳化的解决：溶液分配过程中，往往会出现乳化现象，如不很好的解决，会影响分析结果的准确性。1.加入饱和硫酸水溶液：由于溶液中有大量的硫酸钠离子存在，盐析作用可以使乳化层破坏，（也可以加入适量的氯化钠）。2.加入1：的硫酸水溶液，加入量由10毫升、20毫升、30毫升逐步增加，乳化可以减轻或消除，此法只适用于对酸稳定的农药。3.采用高速离心，破坏乳化层，消化乳化现象。4.根据样品的情况添加，如蜂蜜和炼乳类，可以加草酸钾，茶叶类的可加入丙酮或甲酸，含糖样品，可以加入丙酮。2．在多残留分析中常用极性不同的溶剂体系，把各种农药淋洗入不同的洗提馏分中，使农药得到分组分离，然后测定。MILLS等提出的淋洗体系为A、B、C3种极性依次增大的体系：A液：二氯甲烷：甲醇（19：1）的淋洗体系，分离水果和蔬菜中的一些磷酸酯、有机氯、甲基氨基甲酸脂、苯基氨基甲酸脂和脲类农药。黄士忠等研究采用内径1.5厘米，长18厘米的玻璃层析柱，在柱底部填入少量玻璃棉，先装入4克无水硫酸钠，然后再将入5克处理过的弗罗里硅土，稍加打实，最上层加4克无水硫酸钠。该柱先用30毫升二氯甲烷：石油醚：丙酮（6：3：1）预淋，待预淋液面进入上层无水硫酸钠时，将待净化的浓缩液移入柱中，弃去收集的预淋液，待上液面接近上层无水硫酸钠时，先用50毫升含10%乙醚的石油醚淋，再用120毫升二氯甲烷：石油醚：丙酮（6：3：1）淋洗，控制流速3~4毫升/分，收集二次淋洗液、浓缩、定容。此法分离了土壤和粮食中10种有机氮类农药，其回收率为85~101%。3．酸净化：是化学处理净化的一种方法，它可以有效去除脂肪、色素和杂质。此法只适用于对酸稳定的农药。4．凝结净化法：根据一些有机磷和有机氮农药对净化要求不严格和偏酸性条件下稳定的特点，采用凝结净化法进行净化。在含有30%丙酮或乙腈提取液中加入10~13毫升的凝结液（20克氯化铵和85%磷酸40毫升溶于400毫升蒸馏水中配置，再稀释5倍）和1克助滤剂，振摇15~20次，静止5分钟，过滤，根据杂质和色素的含量，确定凝结的次数。在滤液中加入适用氯化钠（防止乳化），用（50*3）毫升二氯甲烷萃取3次，合并有机相，浓缩、定容。5．其它：氧化铝层析法、活性炭和混合柱净化法等等二、一般试剂的要求、纯化、活化和灭活1.水：取100毫升水，用10毫升石油醚提取，取5微升石油醚提取液，进行分析，在色谱图上，除石油醚溶剂峰外，无其他杂质峰。2.中性氧化铝（层析用），在550℃灼烧4小时密封保存，用前于130℃烘5小时，储存于干燥器中备用。3.弗罗里硅土（60~80目）在600~650℃灼烧3小时，用前于130℃烘5小时，储存于干燥器中备用。弗罗里硅土（Florisil,硅镁吸附剂）是一种合成的硅酸镁，具有很大的表面积，活化3小时以上，然后放在干燥器中避光保存。使用前最好再于130℃下活化过夜，至少加热5小时，用玻璃盖瓶后于130℃处保存或者置于干燥器中。如在室温下保存2天后，需于130℃重新加热。加2%水降活（按重量计）弗罗里硅土，既使用含有30%二氯甲烷的已烷液作为淋洗溶剂，可吸附1克油或脂肪。如用含有10%二氯甲烷的已烷淋洗时，甚至可吸附2克油或脂肪。弗罗里硅土活性的测定：通常认为，1克硅酸镁将要吸附100毫克分子量为200的化合物，则活性比较合适。选用月桂酸作为被吸附的物质。月桂酸分子量在200左右，是固体，比较容易提纯，易溶于已烷中、用酸碱滴定法可以直接测定，操作步骤如下：将2.000克弗罗里硅土放入25毫克标准磨口锥形瓶中，盖上铝箔，在130℃下加热过夜，加塞后冷却至室温，加20毫升月桂酸溶液（内含月桂酸400毫克），塞好后间歇地振荡15分钟。等吸附剂沉下后，吸取上清夜10.0毫升，移入125毫升锥形瓶中。吸取的上清夜中不应带入弗罗里硅土。加入中性酒精50毫升和酚酞指示剂3滴。用0.05氢氧化钠溶液滴定至终点。称取100～200毫克月桂酸，在相同条件下，用0.05N氢氧化钠溶液进行滴定。确定每毫升0.05N氢氧化钠溶液所相当的月桂酸毫克数，则每克弗罗里硅土所吸附的月桂酸值按下式计算:每克弗罗里硅圭所吸附的月桂酸的毫克数(月桂酸值)=200-(滴定的0.05N氢氧化钠的毫升数*每毫升0.05N氢氧化钠溶液所相当的月桂酸毫克数)4.硅胶(60~120目)630℃2小时,冷却至50~60℃3-5%水振摇,密封保存。进柱），柱头顶到头，在拉出1MM，用手拧上，在用扳手板1/8圈。卸下检测器（FPD）死堵，装上螺母和石墨密封垫（柱头尽量朝下，防止碎屑进柱），柱头留15.3CM，用手拧上，再用板头扳1/8圈。老化：连接检测器一端柱头取下，死堵装上。增加新柱用CHANGE校正，由于柱子经常被截，需要重新设置长度等参数时用CALIBRATION5．GC参数3个温度1个速度-进样口、柱温、检测器：载气流速建立方法-GC配置进样-进样口温度-柱子气流-炉温-检测器-AUX辅助设备-信号。设置完毕APPLY不能OK否则会从当前界面退出，方法存盘；从资源管理器删除。6．洗针溶剂：丙酮、甲醇，进行前针可以不用溶剂洗溶剂不能空，废瓶不能满7．毛细管恒压模式，基线稳定，不会过度漂移。温度上升基经上移，流量降