低蛋白高纯度刺参多糖的研制--创新项目

山东省技术创新项目可行性研究报告项目名称：低蛋白高纯度刺参多糖制备方法的研究及产品设计项目承担单位：好当家集团有限公司山东省科学院生物研究所2013年1月一、国内外相关产品与技术发展水平、现状多糖是所有生命有机体的重要组分，并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面具有重要作用。因此，有关多糖的研究越来越受到研究人员的关注和重视。海参多糖是海参体壁的重要组成成分，近20年来，国内外对海参多糖，特别是海参黏多糖及其异构物的药理作用进行研究，证实它有多种药效：（1）增强免疫力。刺参酸性黏多糖能使人白细胞悬浮物中的E花环数量增加，SMIg的表达减少，这是因为它作用于无活性细胞亚群，致使活性的T细胞增加，从而抑制了B细胞活化和SMIg的表达。花刺参多糖对鼻咽癌患者T调节细胞亚群的T4和T8细胞均有明显的诱导和激活作用，两者细胞数量分别增加44.1%和29.1%，且T4细胞增加百分率较T8细胞高。花刺参多糖浓度为5-80mg/mL时，对诱导第4d时的T4和T8阳性细胞数的变化与药物浓度呈正相关。（2）抑制肿瘤。黏多糖对多种实验动物肿瘤的生长具有抑制作用，对MA-737乳腺癌和T-795肺癌生长抑制率分别高达79%和60%以上，并能够抑制MA-737乳腺癌的转移和Lewsi肺癌自然转移。小鼠腹腔注射刺参内脏多糖40mg/mL，对小鼠MA-737乳腺癌和艾氏实体癌的抑制率分别为24.5%和41.2%。刺参粘多糖能抑制小鼠S180肉瘤和乳腺癌细胞的DNA合成，但促进肝细胞的DNA合成。Moon研究了刺参中提取的黏多糖和硫酸软骨素对几种药物所致突变的作用，发现对于黄曲霉素和3，2-二甲基-4-氨基二酚的抑制率分别为84%和98%。（3）抗凝血。刺参多糖有抗凝血作用，刺参体壁黏多糖在体外有明显的抑制血小板解聚作用。Nagase对降解的海参黏多糖进行研究，观察它用于防治凝血酶诱导的兔血栓形成时，发现其抗Xa的活性不依赖于AT-III肝素辅助因子。黏多糖作为一种新型抗凝剂，在凝血过程的不同环节显示多重作用，在正常情况下，黏多糖抗凝活性低于肝素，但在抗凝剂机理和安全性等方面优于肝素。（4）促进纤维蛋白溶解。海参黏多糖可通过激活纤溶酶原而促进纤维蛋白溶解，同时还能抑制纤维蛋白的单体间聚合、改变纤维蛋白凝块结构，从而有利于药物纤溶。（5）降低血黏度。海参多糖在正常中老年人群（48-72岁）中试用具有降低全血黏度及血浆黏度的作用，同时显示还有调节血脂的功能，即降低血清胆固醇和甘油三酯水平，升高载脂蛋白A并降低载脂蛋白B。（6）保护神经组织。海参多糖在体外培养的大鼠皮质神经元试验中，对以β-淀粉样蛋白诱导引起的皮质神经元的损伤或凋亡具有明显的保护作用，海参多糖能防止中枢神经元的退行性病变，例如早老性痴呆症。（7）抑制细菌感染。海参多糖能对抗单纯疱疹病毒所引起的组织培养细胞的特异性病变，同时明显抑制HIV对培养细胞的感染率。另外，海参多糖在慢性肝炎患者“三阳”，及恢复肝功能方面较常规药物治疗效果更佳。海参多糖在海参体壁中以糖肽键与蛋白相连。蛋白是影响海参多糖品质的主要杂质，采用适当方法降低产物中蛋白含量是制备高纯度海参多糖的关键。去除蛋白的方法有多种，通常采用Sevage法及三氯乙酸法等，然而这些方法在去除蛋白时效率低，同时会造成多糖的大量损失，不利于产业化生产。有文献报道采用酶解结合超滤技术制备海参多糖（酶解法制备低蛋白含量海参多糖条件的研究，中国食品学报，2011年10月，第11卷，第7期），这种方法制备出的海参多糖蛋白含量低，是一种较为可行的生产方法。本项目采用酶解-超滤-酶解-超滤偶联法制备海参多糖，提取所得多糖蛋白含量极低，具有纯度高，免疫原性低等特性，是一种很有前景的制备注射用海参多糖的生产方法。二、项目立项的必要性刺参多糖是继手术、放疗和化疗三大治疗手段之后的第四类治疗肿瘤的药物，它通过增强机体的抗肿瘤免疫防御反应或改变机体对肿瘤细胞的生物学效应而产生机体或细胞介导的抗肿瘤效果，发挥间接的抗肿瘤作用。刺参多糖一般可与化疗药物联合使用，将来可广泛用于癌症的辅助治疗。同时刺参多糖具有抗凝血、调节免疫功能。刺参多糖在体外有明显的抑制血小板解聚作用。刺参多糖作为一种新型抗凝剂，在凝血过程的不同环节显示多重作用，在正常情况下，刺参多糖抗凝活性低于肝素，但在抗凝剂机理和安全性等方面优于肝素。三、实施方案1技术特点、关键技术、工艺技术特点：本发明利用干海参作为提取材料，首先，将干海参粉碎至100-300目之间，粉碎后的海参利用正己烷、丙酮或石油醚进行脱脂处理，脱脂后利用乙醇或甲醇进行提取，去除皂苷类成分，经过脱脂、脱皂苷的海参粉浸入于纯净水中，利用蛋白水解酶（内切酶）酶解，酶解液离心，上清液通过10000Da的滤膜超滤，收集截留液，截留液再次利用蛋白水解酶（外切酶）酶解，酶解完毕后，加热，冷却后调节pH为4.5，离心，上清液再次利用10000Da的滤膜超滤，收集截留液，截留液干燥后得海参多糖干品。关键技术：酶解条件、多糖提取条件、超滤条件、干燥条件。工艺：具体实验方案：A、酶解条件的确定：以水解度为指标，考查酶的种类、底物浓度、酶解时间、pH、温度对酶解的影响，寻找水解度高的酶解条件。B、超滤条件：考查初始物料浓度、压力、温度、流速对多糖提取率的影响，确定较佳的超滤条件。2实施方式与山东省科学院生物研究所合作，自主开发，产学研相结合。四、进度与完成期限2013.07-2014.09：资料检索、实验设计2013.10-2014.6：酶解、提取条件的优化海参脱脂脱苷一次酶解超滤二次酶解超滤冷冻干燥成品2013.7-2014.5：超滤条件、干燥条件的优化2013.6-2015.7：工业性实验，组织验收五、主要技术指标a、开发刺参多糖系列产品2个以上；b、申请国家发明专利1~2项。主要创新内容（1）采用酶解-超滤-酶解-超滤偶联法制备海参多糖，制备的海参多糖蛋白含量极低；（2）对产品进行高值化设计，开发的产品具有增强免疫力、辅助放化疗的功能。六、项目资金概算及使用合理性1项目总资金与年度预算项目总投资950万元，其中申请银行贷款450万元，企业自筹500万元。2资金使用范围和资金使用明细2.1项目调研、可行性研究20万元2.2技术研究及试验费300万元厂房、车间设计费40万元产品试制及原材料费100万元测试试验费60万元劳动工资、差旅及管理费60万元技术交流费40万元2.3生产设备、车间建设费250万元2.4不可预见费80万元七、社会经济效益评价1、经济效益：项目达产后产品销售收入2000万元，利税1080万元。2、社会效益：海参多糖不但具有抗肿瘤，提高免疫作用，而且还兼有很好的抗凝作用，亦可作为预防血栓的药。海参多糖作为功能食品前景看好，产业化后，其经济效益估值年销售将超过2亿元。八、项目承担单位财务状况九、项目承担单位及项目协作单位能力（一）、申报单位好当家集团有限公司位于山东半岛最东端，首届中国最具魅力城市，有中国好望角之称的国家4A级景区——荣成市，公司始建于1978年，注册资金8亿7千万，目前，下辖企业50多处，其中国内A股上市公司一家，总资产30多亿元，职工1.2万人，已经形成以食品工业、旅游业、水产养殖与捕捞、造纸发电等制造业为四大支柱产业的行业格局，是一处产业结构多元化、经营规模集团化、经营领域跨国化的国家级企业集团。该集团经济效益连续多年名列全省乃至全国同行业前茅，先后获得农业产业化国家重点龙头企业、全国重合同守信用企业、山东省百强工业企业、山东省高新技术企业等荣誉称号。公司以“一流品质创一流品牌，建设东方食品城”为目标，管理上主动与国际标准接轨，先后通过ISO-9000质量体系认证及美国的FDA认证，取得了HACCP验证证书；注重产品开发与质量，建立了省级企业技术中心——食品研究所，自主开发生产“好当家”牌食品300多个品种，形成年产量10万吨的生产能力，成为我国重要的绿色食品生产基地和出口基地，产品远销日本、美国、欧盟、韩国、香港、台湾等国家和地区，畅销北京、上海等国内20多个省市，并将加盟好当家食品专卖店500家，“好当家”也已成为山东著名品牌，国内知名品牌。（二）、协作单位山东省科学院生物研究所成立于1983年，属省级生物技术研究和开发机构。现有在职职工90名，其中博士18名，硕士29名，具有高级职称人员25名，中级职称人员37名，享受政府特贴人员9名，省级拔尖人才6名，国家级突出贡献的中青年专家1名。现有科研办公建筑面积8000平方米。1999年和2002年相继建成了山东省生物传感器和山东省应用微生物两个开放式的省级重点实验室。主要研究任务和方向是：生物传感器、农业微生物、生物化工、药物筛选、海洋食品、工业微生物、植物细胞与基因工程、分子免疫学、酶制剂等。积极开展国内外项目和技术合作。对外与加拿大、美国、澳大利亚、法国、英国、以色列、独联体等国家和地区的学术机构建立了良好的合作关系，对内与中国科学院、中国农业科学院、中国农业大学、北京大学、清华大学、中国海洋大学等科研机构和知名院校进行广泛的合作——引进智力、引进项目、合作研究、学术交流、互访进修。在人才培养、合作研究和产业开发等方面取得了显著的成绩。建所以来共取得140多项科研成果，获得发明专利16项，国家级新产品4项，国家新药证书2个，农业部登记新农药7项。获得国家发明奖2项、国家科技进步奖1项、省部级科技进步奖20项、厅局级奖励17项。十、项目承担单位签章1、申报单位法人代表签章：2、加盖申报单位公章：好当家集团有限公司