候选蛋白的验证技术

候选蛋白的验证技术免疫印迹法（blotting）:是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。免疫组化法免疫荧光法流式细胞术免疫印迹法WesternBlottingWB=SDS-PAGE电泳+将分离的多肽从凝胶转移至固相支持体+抗原抗体反应步骤：制胶→蛋白样品制备和上样→电泳→转膜→封闭→一抗杂交→二抗杂交→底物显色1.SDS-PAGE电泳原理加入SDS破坏蛋白质的氢键、疏水键，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物，大量SDS结合后，让各种蛋白都带上相同的负电荷（远大于原有电荷量，原有电荷量忽略）和破坏部分的蛋白质空间结构；加入β-巯基乙醇破坏二硫键，破坏蛋白质的空间结构。最终蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。在电场作用下，带有负电荷的蛋白质，向胶板下方移动（+极），分子量小的蛋白质所受阻力小电泳快，位于胶板最下方，分子量大的相反，各蛋白质依分子量被分散于电泳道各处。在不连续电泳时，采用了两种缓冲液，其凝胶孔径、pH值、电泳电压和PAGE浓度不同。上层胶为浓缩胶（大孔径，PH6.8，PAGE5%），下层胶为分离胶（分子筛，PH8.8，电压120V，PAGE根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度）。浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳Buffer的缓冲对为Tris-甘氨酸。胶中的Cl-移动最快，电泳Buffer中的甘氨酸（pI为6.0）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动最慢。而SDS-Protein在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移动速度居第二。即泳动速度为Cl-蛋白甘氨酸离子。加上电压后，氯离子和甘氨酸离子分离开来，在二者之间形成一个导电性较低的区带（因为之间电荷少），由于导电性和电场强度成反比，这一区带的电压梯度较高，又反过来加速位于区带后方的甘氨酸离子的泳动，使其追赶氯离子，建立甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速度乘积相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同的速度泳动（这两种离子之间有明显的边界，电泳调节一定的情况下，此高电压梯度带宽度不变）。蛋白质则以相同的速度和相对固定的位置在此高电压梯度带中泳动，同时受此高电压梯度影响，蛋白质分子被堆积在一起，形成一条狭窄的条带。当此高电压梯度带移动到浓缩胶和分离胶界面时，凝胶PH增高，大量甘氨酸解离并带上负电荷，此时甘氨酸的泳动速率明显增加，超越蛋白质分子，位于氯离子后，使高电压梯度带缩窄，蛋白质则不再位于该带内，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和PH环境中泳动，并根据其固有分子量大小进行分离。2.制胶（先下后上）配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶，按需配体积)：成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71MTris-HCl,pH6.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵（AP）0.020.030.040.060.080.1TEMED（1‰V）0.0020.0030.0040.0060.0080.01依据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度(实质就是丙烯酰胺的浓度)，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶51015203050蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶51015203050蒸馏水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：AP和TEMED是促凝剂，量适当就好，温度高需适当减量，避免过早凝固。不要有气泡，不要漏水、分离胶（1.5mm板多配10毫升体积，高度可调节，至少加到卡槽线；上样枪头要垂直）在一边贴壁流下，少量无水乙醇（压胶，使成水平）均匀由各处流下，待凝固30min（不可过久，否则将吸走分离胶中水分）。倒出多余无水乙醇（醇封需要用ddH2O洗板），在一边贴壁加入配置好的浓缩胶，依据估计上样体积安装适当齿梳，待凝固40min。成胶后缓慢拔出齿梳，用去离子水赶出泳道内气泡（不要对着冲），侧置胶板用滤纸吸出可流出的去离子水（不必全部吸干，操作在保证不损坏胶的前提下进行）。组装仪器，倒入RunningBuffer（内槽新液，外槽旧液）。细安装、查漏水、（RB）内过板、外过线、红对红、黑对黑3.蛋白样品制备和上样蛋白样品制备，用RIPABuffer/生理盐水/超声等充分裂解细胞。成分RIPABuffer所需各成分量和作用Tris-HCl,PH8.0?50mM缓冲对，防止蛋白变性NP-401%非离子型去污剂，裂解细胞Na-deoxycholate1%离子型去污剂，溶解细胞膜NaCl150mM防止蛋白非特异性的聚合SDS0.1%强离子型去污剂，裂解细胞PMSF0.05mM蛋白酶抑制剂之一注：1.激酶的实验禁加Na-deoxycholate，其可变性激酶蛋白，并使其失去活性。2.磷酸酶的实验禁加磷酸酶抑制剂。3.离子型去污剂存在极性头部基团，去污活性较强，尤SDS。SDS会使蛋白质变性并破坏其三维结构，因此当研究蛋白质活性或蛋白质相互作用存在时，禁用SDS。如需去除蛋白质的SDS，可利用SDS低温沉淀特性，钾盐液中更明显。不能通过离子交换色谱去除。4.非离子型去污剂没有极性的亲水基团，是比较温和的表面活性剂，并且多数不能使蛋白质变性，可保留蛋白的天然构象、功能及它们的相互作用。注：用上样针（每次洗5遍）选择适当蛋白上样量（太大上样量会造成“过载”，膜无法完全吸附所需蛋白，反而没条带）。上样时为了简便操作，建议上样体积v相同（m=c*v）。上样前分别测各蛋白样品浓度，用LoadingBuffer或裂解细胞的RIPABuffer配平各上样蛋白浓度（使各组蛋白质浓度相同）并于100℃，10min加热，终止可能的酶促反应，防止提取的蛋白质降解。空白泳道用LoadingBuffer填充(最终使混液变为1X的LoadingBuffer)。加入已知分子量的一系列蛋白混液作为确认分子量的Marker。1.5mm/10泳道胶板：满孔体积50μL，上样体积最好不过其2/3，可选30μL上样体积。1.0mm/10泳道胶板：满孔体积30μL，可选20μL上样体积。主要成分LoadingBuffer所需各成分作用Tris-HCl,PH6.8缓冲对，调节PH甘油增加样品密度，从而沉降于点样孔中，避免飘出0.1%溴酚蓝（BPB）指示剂，紫兰色，显示电泳过程二甲苯氰FF指示剂，兰色，显示电泳过程SDS（部分有）变性酶类，终止酶促反应，破坏氢键、疏水键，加入负电荷5%β-巯基乙醇破坏二硫键4.电泳红对红、黑对黑、调参数、适时停（溴酚蓝到交界）。回收RunningBuffer浓缩胶参数：80V，30mA恒压。原因：低电压可以避免高电压梯度带过宽，使在蛋白移动到浓缩胶和分离胶界面时，甘氨酸仍远未到，甚至让蛋白在分离胶中的泳动也收到该高电压带影响，而产生偏差（在分离胶中蛋白泳动应仅与其自身分子量大小有关）。分离胶参数：110V，56mA恒压。原因：增大电压，让蛋白质在分离胶的泳动更快。成分RunningBuffer所需各成分作用Tris-HCl,PH?构建高电压梯度带的必须试剂，并调节PHGlycine构建高电压梯度带的必须试剂SDS？去离子水溶剂5.转膜转膜参数：依据目的蛋白的分子量来确定。分子量小的所需电压小，反之。示范90V，200mA，恒流，2.5h。三明治：黑（-极）、海绵、滤纸（至少3层）、胶、膜（见下）、滤纸、海绵、红（+极）注：裁剪膜时可在右上角剪一个缺做为标记。制作三明治的时候一定要保证各层之间无气泡（如有可重新“贴膜”或粗针注水驱赶），在加最后一层海绵之前用滚筒赶气泡（个人认为可以每层都用，除了胶膜层），最后一层海绵拧干，避免过大安不上。PVDF膜用甲醇浸泡10s后用去离子水洗3遍。浸润前，在膜上标记上下和蛋白质的前后面，甚至可以描摹Marker。仪器内放冰盒（板靠冰盒），外加冰浴。成分TransferBuffer所需各成分作用Tris-HCl,PH?调节PHGlycine？SDS？甲醇？为什么还要加？去离子水溶剂方法一：依据Marker分子量标记将内参的相应分子量附近条带横向剪开，分别封闭杂交两条膜。一条膜为内参，杂交内参一抗；一条膜为目的蛋白，杂交目的蛋白一抗。方法二：在确保所用一抗间不会互相结合的前提下，可以多个同种属来源一抗同时杂交，用抗该种属的不同来源抗体杂交二抗。优点，结果更可信，更漂亮。缺点，可能会有不符合趋势的条带，一抗液不可回收，成本高。6.封闭用TBST洗膜1遍，加入封闭液，膜的蛋白面朝上，摇床1h。成分封闭液所需各成分量和作用5%脱脂奶粉0.5g填满膜上未被蛋白占据的处，避免非特异性条带TBST10mL溶剂（过会洗膜要用TBST所以用做溶剂）成分TBST所需各成分量和作用10XTBS100mL？去离子水900mL溶剂Tween-20%?1mL非离子型去污剂，减少非特异性抗体结合7.一抗杂交用TBST液洗膜3遍，加入一抗，膜蛋白面朝上，摇床4℃过夜。（单一一抗可回收再利用）成分一抗液所需各成分量和作