免疫学实验设计

IL-35对小鼠的Ⅰ型糖尿病的治疗效果评定及免疫机制的研究138201李麒麟一.立题依据自身免疫性疾病（Autoimmunediseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。Ⅰ型糖尿病(T1DM自身免疫性胰腺炎)就是其中的一员，其机制是体内除了抗原提呈细胞（APC）和活化的T淋巴细胞外正常细胞几乎不表达MHC-Ⅱ类分子，研究表明IFN-γ转基因小鼠的胰岛β细胞分泌IFN-γ，由于IFN-γ刺激MHC-Ⅱ分子的表达这种小鼠的胰岛β细胞高表达MHC-Ⅱ类分子，这样以来免疫细胞就会结合并识别胰岛β细胞然后对其进行攻击，使其丧失胰岛素分泌活性，最终导致体内胰岛素缺乏。临床发现人体发病机制与鼠基本相同，患者往往需要终生注射外源性胰岛素来控制体内的血糖水平。白细胞介素-35（IL-35）是07年新发现的一种独特的免疫抑制性细胞因子，属于IL—12细胞因子家族，IL-35为异源二聚，主要由活化的调节性T细胞（Treg）分泌，对多种免疫细胞和细胞因子均有明显的抑制作用，参与介导机体免疫耐受的形成。二.实验目的通过提高NOD系小鼠（Ⅰ型糖尿病患鼠）体内的IL-35水平，观测小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的Ⅰ型糖尿病发病率、胰岛炎评分等，评定IL-35对Ⅰ型糖尿病的预防及治疗效果，并与其它一些免疫抑制性的药物（环孢菌素A）等，进行药敏对比；体外测定小鼠体内IL-4及干扰素-γ（IFN-γ）的等含量及T淋巴细胞的亚群分化情况及调节性T淋巴细胞的含量等，对小鼠的免疫体质及IL-35对Ⅰ型糖尿病作用的免疫学机制有大体认识及方向把握，为以后的研究打下基础。三.实验对象NOD系和NON系（正常不患病个体）小鼠四.实验材料IL-35试剂，磷酸盐缓冲液(PBS),酶联免疫吸附试验（ElISA）试剂盒，流式细胞仪，CD8及CD4单克隆抗体，注射器等基础实验器械。五.实验方法及步骤1.小鼠的分组与处理实验组,10只NOD系小鼠注射IL-35注射液，每三天注射一次，注射量根据生物试剂公司提供的IL-35试剂说明书为准，连续注射7周.实验对照组,10只NOD系小鼠注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS），注射方式同实验组.正常对照组10只NON系小鼠注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS），注射方式同实验组.2.糖尿病及体重检测从各组小鼠10周龄开始每周记录体重，每天采取断尾方式测血糖含量和尿糖含量，血糖连续2天超过16.00mmol/L即诊断为糖尿病,30周后观察期满终止观察，计算各组小鼠发病率3.胰腺炎严重程度评分30周后，颈椎脱臼法处死各组小鼠，取各组小鼠胰岛做HE色切片进行病理性胰岛炎评分。评分标准：10级：胰岛完整无淋巴细胞浸润，计0分；21级：有胰岛周围淋巴细胞浸润（即胰岛周围炎）或25%的胰岛面积受累，计1分；32级：浸润至胰岛內，25%→50%的面积受累,计2分；43级：50%的面积受累，计3分。记录各组小鼠评分值4.细胞因子水平测定取足等量的各组小鼠外周血用ELISA法检测IL-4及干扰素-γ（IFN-γ）的含量，以为IFN-γ指导Th0向Th1方向、分化IL-4指导Th0向Th2方向分化。5.T淋巴细胞亚群测定取各组小鼠脾脏制成单核细胞悬液，应用细胞流式法进行T淋巴细胞亚群（主要是细胞免疫）计数，结果用百分比表示。6.调节性T细胞检测分选提取大鼠脾脏和淋巴结CD4+CD25+调节性T（Treg）并进行纯度和活性检测。用免疫磁珠两步法既阴性选择和阳性选择分选提取小鼠CD4+CD25+调节性T细胞,流式细胞仪检测细胞纯度,台盼蓝染色法观察计算细胞存活率。7.统计学处理分析应用实验常用统计学软件（SAS,SPSS等）进行大量数据的后处理，整理待分析。六.预期结果及结论实验组小鼠的发病率远低于对照组小鼠发病率，体重较对照组重；且对照组饮食饮水量远多于实验组和正常对照组；血糖和尿糖含量比对照组低并接近于正常对照组（可偏高）；IL-4及干扰素-γ（IFN-γ）的含量实验组数据远低于对照组和正常对照组鼠，提示实验组发生了免疫的抑制（免疫的耐受）；实验组T淋巴细胞亚群分化度和活性较对照组和正常对照组明显偏低；调节性T（Treg）细胞实验组计数和活性较对照组和正常对照组高，提示有免疫抑制及耐受。预期结论IL-35对Ⅰ型糖尿病有明显的抑制或治疗作用；由于IL-35使Th0细胞向调节性T（Treg）细胞分化（优势分化方向）从而抑制T淋巴细胞的其他效应性分化（主要有Th1和Th2方向）使IL-2、IL-4及IFN-γ等主要免疫增强因子的分泌减少，有效抑制了荷主的免疫能力，从整体水平上降低自身免疫病的发生；Treg的活性增值又能分泌IL-35和促进Fas、Fasl途径激活相关基因致使T淋巴细胞凋亡，以上两项从整体水平上降低自身免疫病的发生；IFN-γ分泌的减少还能抑制胰岛β细胞产生MHC-Ⅱ类分子使T淋巴细胞不能对其产生杀伤作用，从而不会引起免疫细胞对自体胰岛β细胞识别与破坏，保证了胰岛β细胞的正常胰岛素分泌功能，维持血糖的正常。七.参考文献【1】金伯泉·医学免疫学·第五版·北京：人民卫生出版社，2008【2】宋文刚·免疫学实验教材·北京：北京大学医学出版社，2010【3】孙黎飞·细胞免疫学实验研究方法·北京：人民军医出版社，2009【4】王培林，傅松滨·医学遗传学·第三版·北京科学技术出版社2011【5】哈佛医学院BrighamandWomen’s医院，eBioscience公司的科学家·Nature·罕见的抑制性因子·美国·2007【6】王嘉军·微生物学免疫学新进展·第37卷，第4期·2011【7】周国庆，唐琴，黄丽，孙保亮·泰山医学院学报，Treg的免疫磁珠提取纯化方法【8】姜小丽，杨婷等·中国免疫学杂志·2013年第四期·哮喘小鼠中Foxp3+Treg/Th17的失衡及意义【9】王建华·糖尿病自我管理全书·北京：北京科学出版社·2010