人体外周血淋巴细胞G带分带及姐妹染色单体色差分析

人体外周血淋巴细胞G带分带及姐妹染色单体色差分析王伊丹（中山大学生命科学学院生物技术与应用基地班广州510275）[摘要]染色体是细胞分裂过程中出现的一种常见结构，在人类染色体研究中外周血是制备染色体标本的重要材料之一而只有获得染色体标本才能进行核型分析。G带染色技术是目前应用最广泛的技术，形成了染色体蛋白质的差异从而有利于染色体研究的进展，姐妹染色单体应用单体区分染色法（sisterchromatiddifferentialstaining,SCD）进行染色研究并统计姐妹染色单体互换（sisterchromatidexchange,SCE），SCE可以作为哺乳动物突变形成的指标，本实验中30个人外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换的平均值为1.57。[关键词]染色体；人体外周血淋巴细胞；G带染色技术；姐妹染色单体区分染色法染色体是细胞分裂过程中出现的一种可见结构，是基因的载体。在人类染色体研究中外周血是制备染色体标本的重要材料之一。染色体是由DNA，组蛋白，非组蛋白组成。DNA链上有A-T丰富区及C-G丰富区，用Giemsa染色，A-T较C-G更易染色。G带染色法是用Giemsa染色，是目前应用最广泛的染色体分带技术之一，染色体标本放到37℃胰酶中是G带显示的一种预处理方式，它可以从染色体上抽取蛋白质特定的成分，从而经Giemsa染色后获得良好一致的分带类型[1]。在DNA复制的过程中，核苷类似物5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）可以代替胸腺嘧啶核苷（T）掺入到新复制的DNA链中，哺乳动物细胞在含BrdU的培养液中培养，第二次分裂后出现双股均含BrdU的DNA，由于双股均含BrdU的DNA分子构型有变化，Giemsa染液染色时就可清楚看到双股都含BrdU的DNA链所组成的单体着色浅，而仅一条链含BrdU的单体着色深。同时统计30个细胞的SCE的数值。目前SCE被列为检测致突变物，致癌物的常规指标之一。1.实验材料1.1人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备实验仪器及试剂有：超净工作台，恒温培养箱，恒温水浴箱，天平，角转离心机，显微镜，离心管，2ml注射器，吸管，量筒，培养瓶，烧杯，试剂瓶，酒精灯，载玻片，切片盒；RPMI-1640培养基，肝素（称取该粉末160mg，用40ml生理盐水溶解，即500单位/ml，55.2kPa灭菌15min），秋水仙素（称取秋水仙素2mg，用50ml生理盐水溶解，6号细菌漏斗过滤，4℃冰箱保存。使用时终浓度为0.4-0.8μg/ml），PHA，双抗（青霉素取4ml生理盐水稀释40万单位，链霉素取10ml生理盐水稀释100万单位），小牛血清，Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），1/15mol/L磷酸缓冲液（PH7.4），Giemsa原液，人体外周血。1.2人染色体G带分带实验仪器有恒温培养箱，恒温水浴锅，显微镜，染色缸，镊子，烧杯，擦镜纸以及吸水纸。实验中用到的试剂为PH6.8磷酸缓冲溶液，PH7.0ICN溶液，PH7.0GKN溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，Giemsa原液。实验材料为人外周血淋巴细胞染色体标本。1.3姐妹染色单体色差分析实验的仪器为超净工作台，恒温培养箱，恒温水浴紫外照射仪，天平，离心机，2ml注射器，习惯，量筒，培养瓶，烧杯，酒精灯，载玻片，擦镜纸，玻片架。试剂为培养液（同外周血淋巴细胞培养液），BrdU液（用无菌青霉素瓶于分析天平称取BrdU2mg，然后再无菌室内加入无菌生理盐水4ml，即500ug/ml，用黑布避光，置冰箱中保存，最好现配现用），2×SSC溶液（0.3mol/L氯化钠，0.03mol/L枸橼酸钠），PH6.8磷酸缓冲液，40μg/ml秋水仙素溶液，1mol/LNa2HPO4溶液（用稀盐酸调节PH至8.0），席夫（Schiff）试剂，亚硫酸水漂洗液，3.5mol/L盐酸，45%醋酸。实验材料为人外周血玻片标本。2.实验流程2.1人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备实验时先配置培养基，用RPMI-1640粉末约800ml三蒸水溶解，再加入其它成分混匀，定容至1000ml，用5%NaHCO3调PH至7.2，用过滤方式灭菌，最后分装至预先高压消毒好的培养瓶中，每小瓶装5ml，塞进瓶塞，胶布封口备用。培养基完成后，进行采血工作，用2ml灭菌注射器吸取肝素湿润管壁，然后用碘酒和乙醇消毒皮肤，从肘静脉才学1-2ml，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内（内含有生长培养基5ml）接种全血0.3ml左右，轻轻摇匀，将其分为3瓶分装的以及两瓶分装的。置37℃培养箱中培养72h，终止培养前3.5h用注射器向培养物中加入秋水仙素，最终浓度为0.4-0。8μg/ml。将72h并经秋水仙素处理的培养瓶从温箱取出，3瓶的每小瓶去上清液1/3注意不要晃动，吹打成悬浮，用吸管把血浆转入离心管，2瓶的装另一管，对于每一管，生理盐水平衡，2000转/分离心8min，去上清液，加入温育KCl低渗液6ml吹打成悬液，置37℃中低渗25min。沿管壁慢慢加入固定液1ml，用吸管吹打均匀，平衡，2000转/分离心8min。之后去上清液，加固定液6ml,吹打，静置15min，平衡，2000转/分离心8min。去上清液，加固定液6ml吹打,静置15min。平衡，2000转/分离心8min。去上清液，加固定液0.5ml吹打至细胞成悬液。高空滴入冰玻片上,边滴边吹，用酒精灯烤干，反面贴标签，放于玻片盒里晾干待用。3瓶分装的一管用于做G带分带，需要滴片8片，2瓶分装的一管用于做SCE统计，需要滴片5片。通常加入秋水仙素是在终止培养前3～4h,由于秋水仙素作用时间较长,获得的染色体标本收缩过度,不便于显带。有研究表明将秋水仙素的作用时间控制在1h15min到1.5h范围内,使染色体标本较为伸展,便于显带和分析[2]。2.2人染色体G带分带实验操作中将8张标本玻片分为两组，酶处理在染色缸中进行，第一组四张玻片标本置于37℃的pH7.0ICN0.25％胰蛋白酶液中60-90秒，即一张玻片上半部分处理60秒，下半部分处理90秒；第二组处理120-150秒，即一张玻片上半部分处理120秒，下半部分处理150秒。处理完成后立即放入pH7.0GKN漂洗15秒，并用吸水纸吸去玻片下端多余液体。将漂洗完成的玻片均放入5％Giemsa染色20min。染色结束后用微流水漂洗玻片并用吸水纸吸去下端多余水分，放置于空气中自然干燥。在10倍的镜头下搜索细胞，在40倍的镜头下寻找中期分裂相及染色体分散好的图像，进行拍摄。2.3姐妹染色单体色差分析姐妹染色单体色差分析采用紫外灯照射法。把染色体标本放在50℃的水浴锅上，盖上2×SSC溶液薄层，用15W紫外灯照射30分钟。照射完毕后用蒸馏水冲去2×SSC溶液，用Giemsa染液染色12分钟。染色结束后，微流水冲洗，空气干燥。在10倍以及40倍的显微镜下寻找图像进行拍摄。同时进行SCE计数，选择分散良好，数目为46的人中期分裂相细胞进行观察计数，凡在染色体端部出现的互换记为一次SCE，在染色体中间出现互换记为两次SCE。凡在着丝粒部位发生一次互换，判明不是两条染色单体在着丝粒部位发生的扭转，记为一次SCE。统计30个细胞进行SCE分析并计算平均数。3.实验结果3.1人染色体G带分带3.2姐妹染色单体色差分析4.实验结果分析因显微镜分辨率以及翻拍的问题，四张图G带分带的情况均不明显。实验者在显微镜下观察时可以较为明显的观察到四张图颜色的变化情况，总体而言是染色的蓝色越来越浅同时观察效果好坏变坏呈现钟形变化，即90s和120s相对较好，60s和150s相对较差。胰蛋白酶处理60s的标本在视野中呈现较为明显的蓝色，可以观察到染色体条带深浅不一颜色的G带。胰蛋白酶处理90s，120s的标本在视野中呈现桃红色，可以较为清晰的观察到明暗相间的染色体G带。胰蛋白酶处理150s的标本颜色非常浅，难以识别染色体G带的明暗相间变化，其原因预测为酶处理时间过长，A-T,C-G区疏水蛋白基本被除去，难以形成疏水环境使燃料沉淀物积累造成染色体G带无法显示明暗相间的条带。因此可以得出，胰蛋白酶处理时间过短过长均不会明显造成A-T,C-G区差别从而使染色体G带明暗相间的效果差。而处理时间适中的胰蛋白酶处理会使视野呈现桃红色，有明显的明暗相间条带。本实验中BrdU-Giemsa发染色平均SCE/个细胞为1.57。该值远远小于正常自然情况下的SCE值，根据以往的研究对100个无诱变的人体外周血淋巴细胞的SCE值进行统计得到的μ=9.3且具有统计学意义[4]。本实验中的平均值过低原因来自于实验标本量，统计细胞量过少，同时显微镜分辨率过低造成的统计误差。SCE的实验技术条件并不十分困难,但实际操作每个步骤要求较严格,关键是要掌握三个环节即配制合格的培养液,让细胞生长良好,才能获得满意的中期分裂相;二是制片中低渗和固定掌握得当,才能使染色体铺展均匀;其三2×SSC液保护下紫外线照射的温度和时间及吉姆萨染色的时间是分化的关键[5]。从本实验得到的图片可以看出实验技术环节没有问题，主要的平均数差异来自于实验条件和实验设计方面。*30个细胞中1-20为实验者自身观察结果，21-30为本组徐泽宇同学观察结果参考文献[1]王金发，戚康标，何炎明.遗传学综合实验教程[M].第一版.科学出版社：王金发,2012.17.[2]关晶田现书等.人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备的几点体会.济宁医学院学报[J].2003.（11）.08[3]周焕庚康雪珍.人类高分辨G显带染色体技术及其初步应用.中华医学杂志[J].198262:543-546[4]周翔程雅玲.人体外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换(SisterChromatidExchangeSCE试验简介.云南医药[J].1983(06)vol.4302-303[5]李一欣徐厚恩.人外周血淋巴细胞SCE率的若干影响因素.国外医学(卫生学分册)[J].1983(04)vol.6403-404ChromosomeGbandingtechniqueandsisterchromatiddifferentialstainingofhumanperipheralbloodlymphocytesYidanWangBiotechnologyandApplicationbaseclass,2013grade,LifeScienceCollege,SunYat-senUniversity,Guzhangzhou,510275[Abstract]Chromosomeisacommonstructureduringtheprocessofcelldivision.Humanperipheralbloodlymphocytesisoneofthemostimportantmaterialtopreparechromosomespecimenandonlyobtainingchromosomespecimencanweanalyzeitschromatid.ChromosomeGbandisthemostwidespreadingtechnology.Itformsthedifferenceofchromosomeprotein,thusitispossibletocarryonthedevelopmentofchromosome.Weusesisterchromatiddifferentialstaining(SCD)tostainsisterchromatidandcountsisterchromatidexchange(SCE).SCEisabletobeastandardformammaltodeterminewhetheritismutedornot.Inthisexperiment,theaverageSCEof30cellsofhumanperipheralbloodlymphocytesis1.57.[KeyWords]Chromosome;Humanperipheralbloodlymphocytes;