人周血淋巴细胞分离液技术要求

人外周血淋巴细胞分离液产品技术要求3.1产品规格及其划分说明250ml/瓶、500ml/瓶、3.2性能指标3.2.1外观乳光或微乳光液体。3.2.2澄清度比重1.077–1.080g/mL3.2.3pH值（每升标示量/L）pH要求为7.1～7.3，允许偏差范围为±0.30。3.2.4渗透压/（m0sm/kgH2O）渗透压为280～340m0sm/kgH2O3.2.5细菌内毒素/（EU/ml）﹤0.53.2.6无菌检查3.2.6.1细菌数不得检出3.2.6.2霉菌数不得检出3.2.7细胞分离实验3.2.7.1细胞形态正常。3.2.7.2细胞分离数量及存活率数量：90%-95%；存活率：95%-98%3.2.8安全性检验项目抗生素：不得检出。3.3检验方法3.3.1外观检测方法肉眼观察为乳光或微乳光液体3.3.2澄清度的测定按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。3.3.3pH值的测定按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅥH进行。3.3.4渗透压的测定按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨG进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5℅。3.3.5细菌内毒素的测定按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。3.3.6无菌检查按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪH无菌检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检测法采用平皿法。3.3.7人周边血淋巴细胞分离计数及存活率检测实验3.3.7.1人周边血细胞分离实验3.3.7.1.1方法提要1）本实验所用容器具及溶液均为无菌，实验操作过程均为无菌操作。2）分离外周血，并计数分离所得细胞及细胞存活率3.3.7.1.2实验试剂和材料1）人外周血：新鲜血5ml(加肝素抗凝20u/ml)2）分离液：本产品样品3）1640无血清培养液4）10%NCS5）3%冰醋酸6）台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒3.3.7.1.3仪器1）医用超级洁净工作台：洁净级别为百级。2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）℅，能在（37±1）℃恒温。3）细胞培养瓶：T25型、无菌。4）玻璃试管5）血球计数板6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。7）水平离心机3.3.7.1.4实验步骤1）分离人周血淋巴细胞A新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1稀释B在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些）C小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。D离心：转速：1500/分温度：20℃－28℃时间：20分钟（注意：不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)E取出试管，看看是不是分为好几层,顺次为血浆---单个核细胞淋巴细胞层－－分离液－－红细胞F用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，备用G用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）H离心。转速：2000－2300r/min（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开)时间：10分钟温度：4℃I震荡后，用培养液重悬至1mlJ取100ul重悬液放于96孔板中留着计数用，然后将剩余细胞悬液在离心机上离心2）计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.a.取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）b.从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x104x4得到的就是细胞的浓度e细胞总数是：细胞浓度x1ml3）培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2（重组人白介素-2）25－50u/孔后，放入培养箱，在（37±1）℃温度条件及（5±0.1）％二氧化碳体积分数条件下进行培养。3）细胞存活率用台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒检测分离的淋巴细胞存活率A台盼蓝染色：吸取100μl重悬的细胞到常规1.5ml或0.5ml离心管内，加入100μlTrypanBluestain轻轻混匀，染色3min（染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。B计数：吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。通常如果要比较精确地进行定量,每个细胞样品至少数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%注意事项：1、试剂(A)、试剂(B)都是无菌的，使用时最好在超净台内进行无菌操作，避免细菌污染。2、台盼蓝对人体有害，请注意小心操作。3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。3.3.7.2分析结果的表述分离后的淋巴细胞纯度在90%-95%之间，存活率在95%-98%之间3.3.8安全性检验抗生素残留量：依据中华人民共和国药典2010年三部附录ⅨA抗生素残留量测定法进行，不得含有青霉素、链霉素以及庆大霉素。3.4术语无