人乳头瘤病毒荧光定量PCR法检测

人乳头瘤病毒(HPV)人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科(papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一种可以引起人类黏膜组织良性及恶性肿瘤的病毒。人乳头瘤病毒直径为55nm，分子量为54000道尔顿，为对称型的20面体，是由DNA核心和蛋白衣壳组成的无包膜双链DNA病毒。由双链DNA（8000个bps）分子的病毒颗粒及包裹其外的衣壳蛋白组成。庞大家族：目前有100+种型别HPV，大约20种型别与癌症相关，根据HPV致癌危险性大小不同，分为高危型和低危型与宫颈癌相关的高危型HPV有:16,18,31,33,35,39,45,51,52,(53),56,58,59,68低危型别有:6,11,(42,43,44)人乳头瘤病毒与疾病低危型HPV主要引起子宫颈良性乳头瘤样变、肛门皮肤和外生殖器疣类病变；高危型HPV主要引起宫颈癌、外阴癌、肛门癌等恶性肿瘤其中HPV16和HPV18是引起宫颈癌的最常见的两种亚型，HPV16与宫颈鳞癌关系最为密切，HPV18易导致宫颈腺癌妇产科门诊（皮肤科、泌尿外科门诊）人乳头瘤病毒的传播途径HPV主要通过直接或间接接触污染物品或性接触传播。1性传播途径；2密切接触；3间接接触：通过接触感染者的衣物、生活用品、用具等；4医源性感染：医务人员在治疗护理时防护不好，造成自身感染或通过医务人员传给患者；5母婴传播：婴儿通过孕妇产道的密切接触人乳头瘤病毒的感染特征HPV感染多为短暂性的，约有80％的女性在其一生中的某个阶段曾经感染。通常HPV在感染后的6-12个月内可自行消失，只有少部分为持续感染。高危型HPV持续感染是激发宫颈上皮恶性转化的最重要危险因素，它能使宫颈癌的发生风险提高250倍，是宫颈癌及癌前病变发生发展的必要条件。一般从HPV最初感染到癌前病变，最终演变为宫颈浸润癌至少需要10--15年。“几乎所有宫颈癌患者的病理样本中均能找到HPV病毒，从而印证了HPV是宫颈癌的主要原因，也使宫颈癌成为目前人类所有癌症病变中唯一个病因明确的癌症。”JanM.Walboomers教授预防HPV感染就可以预防宫颈癌，没有HPV感染就可以不患宫颈癌。中华医学会妇产科分会主任委员北京协和医院妇产科专家郎景和教授宫颈癌的症状（1）阴道流血早期多为接触性出血；中晚期为不规则阴道流血。年轻患者也可表现为经期延长、经量增多；老年患者常为绝经后不规则阴道流血。（2）阴道排液多数患者有阴道排液，液体为白色或血性，可稀薄如水样或米泔状，或有腥臭。晚期患者因癌组织坏死伴感染，可有大量米汤样或脓性恶臭白带。（3）晚期症状根据癌灶累及范围出现不同的继发性症状。如尿频、尿急、便秘、下肢肿痛等；癌肿压迫或累及输尿管时，可引起输尿管梗阻、肾盂积水及尿毒症；晚期可有贫血、恶病质等全身衰竭症状。HPV感染后，70%的人1年内自行清除，90%的人2年内自行清除。未清除而持续感染者发展成为CIN2/3等癌前病变。癌前病变发展到宫颈癌需要8—10年的时间。早检测早发现HPV病毒感染，及时治疗，可阻断宫颈癌的发生。ASC-US：无明确诊断意义的鳞状上皮细胞病变ASC-H：高级别鳞状上皮内病变（LSIL：低度鳞状上皮内病变.HSIL：高度鳞状上皮内病变.）CIN：宫颈鳞状上皮的癌前病变，分为CIN1，CIN2，CIN3级别人乳头瘤病毒的实验室检测目前宫颈癌筛查的方法多采用宫颈细胞学检查及HPV病毒检测。薄层液基细胞学检测技术（Thin-CytologicTest，TCT）二代杂交捕获技术(HC2)实时荧光定量PCR技术阴道镜活检一组织病理学通过采集阴道或宫颈分泌物，获得脱落细胞后浸入液基细胞处理试剂中进行处理，试剂中的裂解成分能对红细胞进行裂解，去除红细胞对检验结果造成的干扰；同时试剂中的固定成分能保存固定白细胞、脱落上皮细胞等有价值的细胞；并使包裹在黏液中的有效细胞充分分离出来，防止有价值细胞的丢失。将有效细胞制备成细胞悬液，最后通过过滤离心方法清除黏液对制片的干扰，制成脱落细胞薄片。可用HE染色、巴氏染色或其他免疫组织化学染色等方法使细胞着色，再通过人工观察分析来检查阴道或宫颈的细胞形态，诊断子宫颈癌及其癌的前期变化、人乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒感染。同时还能发现部分癌前病变，微生物感染如霉菌、滴虫、病毒、衣原体等。薄层液基细胞学检测技术(TCT)5计算机判读15min后2DNA-RNA杂交60min3抗体捕获60min4化学发光检测30min1DNA分解45min原理:利用对基因杂交、化学发光、信号放大的原理在分子水平定性定量检测病毒DNA（1）样本DNA双链被释放并分解为核苷酸单链；（2）DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体；（3）特异性抗体(一抗)将RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上；（4）结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交体结合,使化学发光物质信号放大（5）碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，通过仪器分析从而确定RNA-DNA的含量。二代杂交捕获技术(HC2)TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。实时荧光定量PCR技术阴道镜活检一组织病理学视为“金指标”，但其有创伤性不作为常规的筛查手段。细胞涂片检查敏感性一般在55%～80%左右，但一旦发现异常细胞，特异性可达到90%以上。HPV检测虽敏感性高，但特异性一般只在64%～95%之间，这是由于大多数HPV阳性的病人可自然转阴，并不导致宫颈癌的发生。人乳头瘤病毒的实验室检测方法的比较《宫颈癌筛查指南》---筛查策略筛查对象：三年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女起始年龄：经济发达地区：25-30岁经济欠发达地区：35-40岁高危人群：起始年龄应相应提前（高危人群定义为有多个性伴侣、性生活过早、HIV/HPV感染、免疫功能低下、卫生条件差、性保健知识缺乏的妇女）终止年龄:65岁以上危险性极低筛查间隔每年一次细胞学筛查，连续2次正常可改至3年连续2次HPV和细胞学正常可延至5-8年.随访对象细胞学≥低度鳞状上皮内病变(LSIL)、组织学≥CINⅠ特殊职业人群、30岁以上高危HPV感染者至少每半年一次《宫颈癌筛查指南》---筛查推荐流程HPV检查前的注意事项1.检查前48小时内不要做阴道冲洗，不要再阴道内用药物；检查前不要进行醋酸或碘液涂抹。2.检查前48小时最好不要进行性生活，月经期间不宜进行HPV检查。如何看待HPV检测结果1.HPV检测结果阴性，表明没有感染HPV，结合细胞学检测结果为阴性，3—5年不会发生宫颈癌。2.HPV检测结果为阳性，表明有HPV感染，若同时细胞学阴性，则无需临床治疗，但需要随访追踪，不可忽视。若HPV检测和细胞学同时为阳性，应进一步检查。HPV检测的意义HPV分型：感染的HPV类型预测受检者HPV阳性的发病风险度，决定其筛查间隔，预测患病风险；有效对HPV阳性病人进行很好的随访监控，即可避免对病人进行过度治疗，又可控制病人的病情发展：HPV基因分型检测结果对宫颈病变病人手术前后随访提供依据。HPV定量:HPV病毒载量与宫颈病变严重程度在一定的含量阈值内有关，高水平的HPV载量可以促进宫颈病变的发生发展。一旦检出HPV高危型别感染，定量检测不仅使患者了解感染的HPV型别，而且还能获知HPV病毒的复制情况，为下一步检测或治疗提供帮助。