人类X染色体的制备与观察

人类X染色质的制备与观察摘要：本实验旨在掌握鉴定人类X染色质的方法，通过将人体口腔颊部粘膜细胞和毛囊细胞解离、染色等步骤制片，在显微镜下正确识别X染色质，即Barr小体的形态特征及所在部位。同时了解X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点。1引言：1949年加拿大学者Barr和Bertram在一些雌猫神经原细胞核中,发现在核膜内缘有一个染色较深的近似三角形的小体,在雄猫中没有发现。根据后来的深入研究发现，这个染色较深的小体和性别有关。直到1971年巴黎会议上正式被命名为X染色质。以后的研究表明巴氏小体是一个异染色质化的失活的x染色体。在正常的男性细胞中只有一个X染色体,是正常有活性的,因此男性细胞中没有巴氏小体。而在正常女性细胞中有二个X染色体,其中一个正常,另一个异染色质化因此在女性细胞中可见到一个巴氏小体。巴氏小体的个数=X染色体个数一1，大都出现在核膜边缘。性染色质在人类中，正常男性个体出现的比例约为1%，正常女性约为17-39%，在由性染色体数目异常而引起的性别畸型(XO除外)患者的细胞中,可见到一个或一个以上巴氏小体。因而通过巴氏小体检查可鉴别胎儿的性别和诊断性染色体异常引起的遗传疾病。1961年,英国遗传学家Lyon根据前人和自己的研究发表了莱昂假说,明确提出了单个X染色体随机失活从而在两性间保证X连锁基因转录水平一致的论点,并为现在的科学家所普遍接受。普遍认为,巴氏小体的形成是与一个非编码RNAXIST的大量且特异表达有关,大量的XIST顺式作用在其中一条X染色体上,引发了该条染色质的广泛甲基化从而导致异染色质的形成,使其上的基因出现表达沉默现象。2实验材料和方法：2.1实验材料和仪器：1）显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、牙签；2）硫瑾染液；3）1mol/L的HCl、蒸馏水；4）口腔颊部粘膜细胞和毛囊细胞。2.2实验步骤和方法：2.2.1口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察1.取材：用清水漱口3-4次，然后用干净的牙签圆顶端从口腔女性口腔内侧轻轻刮粘膜，原位刮2-3次，涂于干净的载玻片上，晾干；注意：刮口腔上皮时要漱口，避免杂志过多，做成的装片不清楚；也不要太过用力，以免划破口腔。2.解离：滴一滴1MHCl于载玻片上涂抹口腔粘膜细胞处，放于水平处解离10分钟；3.漂洗：轻轻倒掉剩下的盐酸，然后正面向下在不急的水流下冲洗载玻片反面，使水从反面流向正面冲掉盐酸。注意：漂洗不能直接冲洗有细胞的正面，否则会冲掉细胞。4.染色：用硫瑾染液滴到载玻片有细胞处，染色6-8分钟；用同3步的方法漂洗载玻片，必要时可用酒精脱色，然后晾干镜检。注意：染色时间可以自己把握。经过实践，可以先染得较深，如8分钟，然后再用酒精脱色，这样整个细胞核的着色就会比较均匀，而巴氏小体也可以显现出来；但如果想要背景颜色浅一些，就可以只染6分钟左右。2.2.2发根细胞巴氏小体观察1.取材：拔取带毛囊头发一段；注意：将没有毛囊一段截去一部分，以免头发太长造成手误。2.解离：将毛囊端整个放入45%冰醋酸解离5分钟；3.小心的用解剖针剥取毛囊；注意：在这里剥取毛囊时主要是将白色部分剥取下来，因为解剖针比较尖细，要防止将黑色素剥取下来；另外在剥取时可以顺便一点点剥取以使细胞散开，让下一步敲片时细胞不容易分散。4.硫瑾染色6-7分钟；5.压片观察（压片前可先用解剖针敲片，使细胞分散）。镜检注意：选择核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质的细胞观察。3结果（解说和图片）巴氏小体在显微镜下为一结构致密的浓染小体，一般靠近核膜处，约1-1.5微米大小。形状多样有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。巴氏小体主要的特征：致密、深色、边缘化，极少数会在中央。正常女性口腔粘膜细胞中，X染色质约15%左右，平均16.4%，不超过30～35%，仅含1个X染色质。男性只有0～3%，平均0.7%。图1本人毛囊细胞（10×40）图2本人口腔粘膜细胞（10×40）图3男生毛囊细胞（没有发现巴氏小体）（10×40）４结果分析分析：用我自己的，即女生的毛囊细胞和口腔粘膜细胞均有观察到巴氏小体，因为口腔粘膜细胞分布比较均匀，用它来计数，通过统计染色较均匀的细胞数目和其中有巴氏小体数，得出41个细胞中共有9个巴氏小体，有巴氏小体率约为22%，有些染色较深的细胞未数，所以数据有波动，但也比较正常。一开始因为染色较浅的缘故，有比较多的深色颗粒，不好判断，就再染了3分钟，然后用无水乙醇脱色，染色才比较均匀。实验过程中需注意：由于制片过程不够精细，或多或少会使载玻片上掺杂杂质，细小的颗粒也被染色，我们便无法辨认事业中颜色较深的是巴氏小体还是杂质，此时可以调节细准焦螺旋，一般巴氏小体的清晰程度会和细胞核颜色同步变化，而其他杂质不会同步变化，这是因为巴氏小体和细胞核处在同一焦平面。５参考文献：[1]陈凡国,侯丙凯.巴氏小体案例在遗传学教学中的应用[J].遗传,2012,04:125-130.[2]李玉莺,阮家超.巴氏小体实验[J].生物学教学,1982,02:41-42.[3]遗传学实验.