人类X染色质的制备与观察

人类X染色质的制备与观察摘要X染色质（巴氏小体）是除一条X染色体外，其余的X染色体常浓缩成染色较深的染色质体。本实验选取口腔粘膜细胞和毛囊细胞，通过解离、染色、压片等方法观察巴氏小体在细胞核内的分布及形态等特征，并且通过显微观察对巴氏小体进行计数，估计巴氏小体在不同性别和不同性格人体细胞中的出现率。此外，了解X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点也是本实验的目的之一。关键词X染色质（巴氏小体）口腔黏膜细胞毛囊细胞1.引言X染色质小体（巴氏小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1μm、贴近于核膜边缘的染色小体。巴氏小体在细胞分裂间期细胞核中出现异固缩现象，表现出浓缩、染色深、无活性的特点。巴氏小体在不同细胞中呈现不同的形态，有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。一般来说，正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。1949年，加拿大学者Barr在雌性猫神经元核仁附近发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现，Barr称这种小体为“核仁随体”，并推测小体是由两条性染色体的异染色质衍化来的。1955年，Barr在女性的口腔细胞中发现Barrbody（巴氏小体），Moor与Barr用口腔黏膜上皮细胞检测Barrbody，制作出日后被广泛使用的颊涂片。1959年，人们把性染色体异常造成的畸形与巴氏小体的研究联系起来。1960年，Ohno和Hauschka发现，X染色质小体实际上是一条在细胞分裂间期，收缩的、异染色质化的X染色体，与核仁并无关系，也不是Barr推测的那样由两条性染色体各贡献一部分异染色质形成。受此启发，Lyon（1961，1962）研究了小鼠X染色体连锁的皮毛颜色基因突变体，进一步指出异染色质化的X染色体可以来自父方，也可以来自母本；异染色质化的染色体在遗传上没有活性（后来的研究表明异染色质化的染色体中还是有部分基因保持活性）；这种随机失活是性别决定为XX-XY的动物为平衡两性之间性染色体上的基因剂量而采取的一种特殊的调控方式（因为Y染色体上的基因数量很少，因此雌性个体必须通过减少X染色体上基因剂量的方式使两性个体间基因剂量取得均衡），即所谓的“剂量补偿”，这是X染色体失活的意义所在。在一个个体中，不论其X染色体数目是几个，保持活性的仅一个，也即X染色质数等于一个个体的X染色体数减1。几乎与Lyon同时，Beutler等（1962）在研究红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺陷症嵌合体女性时发现，这种女性的红细胞可分为两类：一种是缺陷型的，一种是正常的；他们独立提出了Lyon类似的思想。随着对巴氏小体研究得深入，人们对X染色体失活的机制、不同物种的剂量补偿方式及机制等问题进行了广泛、深入地探讨，成了生物学研究的热点问题。目前虽然很多问题并未完全弄清，但取得了不少进展。据研究，X染色体的失活始于胚胎发育早期（从玳瑁猫成片的毛色，而不是成点状的毛色可以看出），在X染色体长臂靠近着丝点的一段序列控制X染色体的失活，这段序列称为X染色体失活中心（XIC），将这段序列通过易位方式转移到常染色体，也能引起常染色体失活。XIC中含有一个转录后不翻译的RNA基因：Xist，它的表达量与X染色体的失活有关。用标记的XistRNA与正常女性体细胞进行原位杂交，结果显示XistRNA所处的位置正是X染色质小体出现的位置。目前，有许多科学家都对XIC进行了研究，因为弄清楚XIC的机制可以解决以下重要问题：①染色体失活的基因调控机制；②表观遗传学的机制；③对干细胞机制的理解；④细胞分化过程的研究。在临床上，通过重新激活巴氏小体也成了应对与X染色体突变有关的疾病的一种治疗方案。在人类遗传学工作中巴氏小体也有其用途：①巴氏小体的临床意义在于鉴别性别。例如，从胎儿羊水中取得脱落的细胞检查，如有巴氏小体，胎儿为女性，如果细胞中无巴氏小体，胎儿为男性。②在优生学中，对于鉴别性别和预防性连锁疾病的发生有重要价值。如：有助于Turner综合征之诊断，患者的卵巢组织被条束状纤维所取代，故缺乏女性激素．导致第二性征不发育和原发性闭经，是人类惟一能生存的单体综合征。通常其X染色质为0%；若是45，XO/46，XX嵌合体则仍可查到X染色质，但数量明显少，15%。反之，如是47，XXX、48，XXXX或49，XXXXX则可在同一核内见到2、3或4个X染色质，并且阳性率也大大超出35%，故有助于推断X染色体之数目，进而有助于相关遗传病之诊断。在本实验中，我们将选择口腔颊部黏膜细胞和毛囊细胞两种材料，解离、染色、压片等方法观察巴氏小体在细胞核内的分布及形态等特征，并且通过显微观察对巴氏小体进行计数，估计巴氏小体在不同性别和不同性格人体细胞中的出现率，并推测巴氏小体的形状和供应者性格的关系。2.材料和方法2.1实验材料、器具和试剂实验材料：口腔黏膜细胞、毛囊细胞实验器具：盖玻片、载玻片、牙签、镊子、解剖针、吸水纸、记号笔、显微镜实验试剂：1mol/LHCl、蒸馏水、硫瑾染液、45%的冰醋酸2.2方法2.2.1口腔颊部黏膜细胞巴氏小体的观察（1）取样取一个干净的载玻片，用记号笔在即将涂细胞的一面作标记。先用水将口腔漱净，尽可能除去口中的杂物。然后用牙签钝头在口腔一侧用力刮取，弃去第一次得到的刮取物，在同一部位继续刮取。将刮得的细胞涂抹在干净载玻片上。反复几次，使载玻片上的材料尽量抹厚些。在涂抹部位的反面画一圈以示样品部位。（2）解离与染色将载玻片晾干后，用1mol/LHCl解离10分钟。之后弃去HCl，水洗3次。然后用硫瑾染色3~8分钟。最后漂洗并且晾干。（3）镜检选择核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质的细胞观察。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。2.2.2毛囊细胞巴氏小体的观察（1）取样拔取一根毛根比较大的毛发，并使毛根至于载玻片中央。（2）解离、染色与压片在毛根处滴一滴45%的醋酸，解离5min。待毛根稍软后用镊子尖或解剖针尖将外层毛囊的组织细胞轻轻刮下。弃去毛干。用硫瑾染色5~10分钟，压片观察。（3）镜检选择核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质的细胞观察。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。3.结果10×40显微镜下观察的口腔黏膜细胞与毛囊细胞如图所示。图高倍镜下口腔黏膜与毛囊细胞图1女生口腔黏膜细胞装片（引自肖懿）图2男生口腔黏膜细胞装片（引自郭星宏）图3女生毛囊细胞装片（引自田海蓉）图4男生毛囊细胞装片（引自李恺鹏）图5女生口腔黏膜细胞装片（引自杨亚爽）图1是10×40显微镜下我自己（女）的口腔黏膜细胞，我的巴氏小体（箭头所指处）很小，不易观察到，呈卵圆形。图2是10×40显微镜下郭星宏（男）的口腔黏膜细胞，视野中多数细胞没有观察到巴氏小体，但是有极少部分细胞可以见到很小的巴氏小体（箭头所指处）。图3是10×40显微镜下田海蓉（女）的毛囊细胞，毛囊细胞是多核细胞（方框内），视野中可以看到卵圆形的巴氏小体（黑色箭头所指处）和三角形的巴氏小体（红色箭头所指处）。图4是10×40显微镜下李恺鹏（男）的毛囊细胞，视野中没有看到巴氏小体。图5是是10×40显微镜下杨亚爽（女）的口腔黏膜细胞，选择核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质的细胞观察有巴氏小体的细胞占符合观察要求的细胞的比例为30.1%。视野中有卵圆形的巴氏小体（黑色箭头所指处）、线状的巴氏小体（红色箭头所指处）和月牙形的巴氏小体（黄色箭头所指处）。图中观察到的巴氏小体大多数大多为卵圆形并且位于核膜边缘，由于在细胞周期S期中，异染色质比真染色质更晚进行复制，所以它的螺旋化与其他染色体不同步，而至使巴氏小体被推挤到核膜边缘。男性细胞中（图2）观察到巴氏小体是正常现象，因为在极少数情况下男性的X染色体可进入异染色质状态，从而成为被观测到的“巴氏小体”，这类细胞通常是暂时活动减弱或进入休眠的细胞。4.讨论（1）载玻片的清洁程度对细胞的观察很重要。尽管使用前载玻片已事先浸泡在乙醇中，能起脱脂作用，使细胞易于贴附在载玻片上，但是在观察时仍然能够观察到载玻片上的脏东西，若是用洗洁精洗涤载玻片，再放入乙醇中虑洗，则能获得更好的观察效果。（2）载玻片从乙醇中拿出后要自然晾干，不要用吸水纸擦，否则会将吸水纸上的絮状纤维留在载玻片上。（3）在取口腔颊部黏膜细胞的时候，要弃去第一次得到的刮取物，在同一部位继续刮取以获得深层的表皮细胞。（4）在刮取口腔颊部黏膜细胞时要力度适当，力度太小会导致视野中细胞过少，达不到计数目的，力度过大刮下一层肉也是没有必要的。（5）口腔颊部黏膜细胞获取后不要让材料在空气中过分干燥，否则会使细胞变形。将样品在空气中刚刚晾干，这样细胞就能够紧贴在载玻片的表面。（6）用HCl酸解口腔颊部黏膜细胞的目的是：①杀死细菌，尽量减少细菌污染；②使细胞结构软化，容易压平并观察。（7）口腔颊部黏膜细胞的水洗过程要用滴管在正面轻轻滴水或在载玻片反面冲水以洗去解离液。不要正面冲水，以免水流将细胞冲走。（8）口腔颊部黏膜细胞和毛囊细胞在染色的时候，时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分；过短则着色不够，难以观察。（9）当口腔颊部黏膜细胞或毛囊细胞着色过深时，可以用95%的乙醇从载玻片样品上方顺着冲洗染色处，使样品染色变浅。（10）毛囊细胞在取样时，要尽量选用白色或浅颜色的毛发，这样在制片中就可减少色素的干扰。（11）毛囊细胞解离完之后，要用镊子尖或解剖针尖将外层毛囊的组织细胞轻轻刮下，如果用力太大，就可能将毛发上的色素细胞一起刮下，而影响制片的效果。（12）毛囊细胞压片前可先用解剖针敲盖玻片，使细胞分散。（13）观察细胞的时候，如果视野中杂质太多，就要用清水反复冲洗，以获得更好的观察效果。（14）镜检时，要选择核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质的细胞观察。巴氏小体在显微镜下为一结构致密的浓染小体，一般靠近核膜处，约1-1.5微米大小。形状多样有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。（15）每个同学的巴氏小体形态各异，在找巴氏小体时，不能心急，在找到巴氏小体后，要明确自己巴氏小体的形态特征，这样以来，就能准确定位其他细胞中巴氏小体。（16）就算是女性，巴氏小体也不是每个细胞都能看到，因为观察角度不同，可能会被遮掩，男性也会有X染色质小体，因为男性细胞中的X染色体在极少数情况下可进入异染色质状态，从而成为被观测到的“巴氏小体”，这类细胞通常是暂时活动减弱或进入休眠的细胞。在正常女性口腔粘膜细胞中，X染色质约占15%左右，平均16.4%，不超过30~35%，仅含1个X染色质。而在正常男性口腔粘膜细胞中，X染色质只占0~3%，平均0.7%。（17）有的同学在观察口腔颊部黏膜细胞时，看到了两个巴氏小体，是因为她将自己口腔细胞与细菌弄混了，在区别口腔细胞和细菌时，可以调节细准焦螺旋，一般巴氏小体形状不会变化，而细菌一般会有变化。这是因为巴氏小体和细胞核应该处于同一焦平面，而细菌和细胞核则不处于同一平面。（18）巴氏小体的大小和提供者的性格有一定关系，我是相对于女汉子的性格，思维比较女性化，所以我的巴氏小体（图1）很小；而田海蓉是典型的文艺女青年，说话温和，与之相符的，她的巴氏小体（图4）比较大并且清晰易辨；郭星宏是说话比较有书生气，不像大多数男生那样热爱体育运动，他的巴氏小体（图2）和其他男生相比比较容易观察到；李恺鹏的性格则比较刚烈，热爱体育运动，他的细胞中（图3）很难找到巴氏小体。（19）此次观察的巴氏小体（图5）的概率为30.1%，大于平均值16.4%，一是可能装片展开得比较好，所以很多巴氏小体都看到了；也可能有的黑点被误当做巴氏小体参加了计数，因为这次计数本来就是一个很主观的过程，就算同一个细胞不同的人也会有不同的结论。（20）研究好巴氏小体的形态机制对解决以下问题有很大帮助：①染色体失活的基因调控机制；②表观遗传学的机制；③对干细胞机制的理解；④细胞分化过程的研究。因此，我们以后也可以考虑从巴氏小体入手展开与这些问