人肺癌裸小鼠模型活体成像的动态观察

人肺癌裸小鼠模型活体成像的动态观察闫明霞1，吴海燕2，朱淼鑫1，刘蕾1，荚德水1，孔韩卫1，姚明1（1.上海市肿瘤研究所实验病理研究室，上海200032；2.扬州大学，扬州225009）[摘要]目的：建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞系，并探讨小动物活体荧光成像系统在皮下移植瘤模型中的应用。方法：应用慢病毒转染的方法建立表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞系NCI-H460-GFP,并接种至裸小鼠体内建立皮下移植瘤模型，通过小动物活体成像系统连续5周观察肿瘤在动物皮下的动态生长情况。结果：建立了转染率接近100%的NCI-H460-GFP细胞系，在体外及裸小鼠体内均能够长期稳定表达绿色荧光蛋白。活体荧光成像观察发现：1-4周随着肿瘤体积逐渐增大，平均荧光量子数也逐渐增加，5周时随着肿瘤出现明显坏死，平均荧光量子数呈现下降趋势。结论：稳定表达绿色荧光蛋白的NCI-H460-GFP细胞系及其动物模型可以为肺癌研究提供理想的实验材料，应用小动物活体成像系统能够客观定量评价肿瘤在动物体内的生长情况。[关键词]人肺癌；活体成像系统；裸小鼠；绿色荧光蛋白;慢病毒载体DynamicobservationofinvivobiofluorescenceimagingofGFP-transfectedhumanlungcarcinomainnudemiceYANMing-xia1,WuHai-yan2,ZhuMiao-xin1,LiuLei1,JiaDe-shui1,KongHan-wei1,YAOMing1(1.DepartmentofExperimentalPathology，ShanghaiCancerInstitute，Shanghai200032，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)[ABSTRACT]Objective：Toestablishahumanlungcarcinomacellline,whichcanstablyexpressgreenfluorescentprotein,anddiscusstheapplicationofinvivobiofluorescentimagingsysteminanimalmodel.Methods：HumanlungcarcinomaNCI-H460cellsweretranfectedwithgfpgenebylentiviralvector,andtheyweretransplantedintothesubcutaneousofthenudemiceforpreparingthetumor-bearingmice.Thebiofluorescentsignalsweredetectedinsequentialfiveweeksusinginvivofluorescentimagingsystem.Results：WehadsuccessfullybuiltupahumanlungcarcinomaNCI-H460-GFPcellline,whichcandisplaystablehigh-levelGFPexpressioninvitroandinvivo.Invivofluorescentimagesshowedthatthefluorescentintensitiesgraduallyincreasedwiththeincreaseoftumorvolumeinnudemicefromoneweektofourweeks,whereasfluorescentintensitiesdidn'tagreewithcaliper-measuredtumorvolumeinthefifthweek.Conclusions：ThishighGFP-expressingcelllineandanimalmodelmaybeusefulforthestudyoflungcarcinoma,andinvivofluorescentimagingsystemwasfittedforevaluationandquantitationofthetumorgrowth.[KEYWORDS]：Humanlungcarcinoma;Invivoimagingsystem;Nudemice；Greenfluorescentprotein;lentiviralvector活体成像技术是近几年新兴的一项技术，它是利用活体生物发光或荧光成像技术直接监测活细胞在动物体内的生物学行为及跟踪分子信号，是检测实验动物体内细胞及分子事件的强有力手段，目前已成为医学、生物学及药物开发等[1-5]研究领域发展最迅速的前沿技术。国内在活体成像技术方面的工作刚刚起步，相关技术尚不成熟。本实验旨在建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺癌NCI-H460-GFP细胞系的基础上，应用活体成像技术动态观察细胞在体内、外的荧光表达情况，为肺癌的深入研究提供理想的实验材料及客观的参考依据。1材料与方法1.1材料1.1.1人肺癌细胞株人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460来源于国家癌基因及相关基因重点实验室，该细胞在体外用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养。1.1.2实验动物SPF级BALB/c－nu/nu裸小鼠7只，6～8周，体重18～22g，雄性，由上海市肿瘤研究所提供[实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2007－0001]，实验操作及动物饲养严格按照SPF级标准要求进行[实验动物使用许可证号为SYXK(沪)2007－0001]。1.1.3仪器和试剂小动物活体荧光成像系统购自德国BertholdTechnologiesGmbH＆Co.KG，型号为LB983NC320，分析软件为WinLight32。荧光显微镜购自OLYMPUS公司。来源于人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的慢病毒载体系统的3种包装质粒PWPXL-GFP、PAX2、PMD2G均来自tronolab公司。胎牛血清购自HyClone公司（LotNo.：NSF0050），培养皿及培养板等购自GreinerBio-oneGmbH。1.2方法1.2.1细胞转染病毒包装：将293T细胞铺于10cm培养皿，每10cm培养皿含2-2.5×106个细胞，第二天进行细胞转染。3种质粒PWPXL-GFP20μg，PAX215μg，PMD2G6μg加水至500ul，加入500ul2xHBS，混匀。加入50ul2.5MCaCl2，轻轻混匀，室温放置20-25分钟后滴加入培养基中。6-8小时后，更换培养基。第四天收集培养基，3000rpm室温离心5分钟，0.45μm滤膜抽滤。病毒可直接用于转染或-70度保存。病毒感染：将NCI-H460细胞铺于24孔板，每孔2×104个细胞。将Polybrene加入24孔板中，终浓度为4μg/ml。加入慢病毒，MOI=1000。荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达。1.2.2稳定转染细胞的活体荧光成像检测取生长旺盛的稳定转染细胞，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）常规消化，计数后调整细胞浓度，按50μl体积含10，100，1000，1×104，5×104，1×105，5×105，1×106个细胞依次滴加于黑色遮光纸，活体荧光成像系统（发射波长为520nm，激发波长为480nm，曝光时间为1s）检测各细胞浓度的荧光表达情况。1.2.3肿瘤体内生长的活体荧光成像观察收集生长旺盛的连续传代细胞，调整细胞浓度为1×107个/ml，分别取0.2ml接种于3只裸小鼠右背侧近腋部皮下。当皮下移植瘤长至直径约10㎜左右时剥取出移植瘤，剔除纤维包膜及出血坏死部分，切取生长良好、淡红色、鱼肉状的瘤组织，将其剪切成若干1.5㎜×1.5㎜×1.5㎜的小块，用20号套管针将肿瘤小块逐个移植至其他4只裸小鼠皮下，从而建立皮下移植瘤模型。每周游标卡尺测量皮下移植瘤直径，计算移植瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。使用小动物活体成像系统检测GFP表达的发射波长为520nm，激发波长为480nm，曝光时间为1s。每周观察皮下移植瘤生长情况，并定量分析各时间点的荧光值，连续观察5周。以肿瘤接种天数为横坐标，肿瘤接种部位单位面积荧光值为纵坐标，绘制皮下肿瘤生长曲线。1.2.4统计学处理将所有数据用SAS8.2软件进行处理，相关性采用SPEARMAN等级相关进行分析，双侧检验水准为α＝0.05。计量资料以均值±标准差（x±s）表示。荧光值按公式：平均荧光量子数=总量子数/荧光面积进行计算。移植瘤体积按公式：V=a×b2/2(V为瘤体积，a为长径，b为短径)进行计算。2结果2.1GFP标记的肿瘤细胞GFP标记的NCI-H460细胞为多边形上皮样细胞，贴壁生长，荧光显微镜观察可见细胞表达的荧光信号较强，荧光较为均匀地分布于整个细胞内，转染率接近100%，细胞在体外能够稳定表达绿色荧光蛋白，并且随体外长期传代培养无明显消退（图1）。图1稳定高表达GFP的NCI-H460-GFP细胞(A)NCI-H460-GFP细胞荧光图（×200）(B)NCI-H460-GFP细胞明场图（×200）Fig．1Stableandhigh—levelGFPexpressionNCI-H460-GFPceilsinvitro(A)ImageofNCI-H460-GFPcellsvisualizedwithaninvertedfluorescencemicroscopy(200×magnification).(B)Imageof(A)visualizedwithaninvertedmicroscopy(200×magnification).○A○B2.2活体荧光成像检测NCI-H460-GFP的体外表达通过活体荧光成像系统观察NCI-H460细胞不同浓度的荧光表达，结果可见：该成像系统能够检测的最小细胞数为100个肿瘤细胞，仪器灵敏度较高，随着细胞浓度的递增，荧光表达的强度也逐渐增加，即平均荧光量子数与细胞浓度成正比(图2)。1×1065×1051×1055×1041×104100010010ABC05000000100000001500000020000000250000003000000035000000400000001×1065×1051×1055×1041×104100010010NumberofcellsMeanfluorescentintensity（ph/s/mm2)图2活体荧光成像系统观察不同浓度细胞的绿色荧光蛋白表达(A)不同浓度NCI-H460-GFP细胞活体成像伪彩图(B)不同浓度NCI-H460-GFP细胞活体成像软件分析参考图(C)不同浓度NCI-H460-GFP细胞荧光定量Fig.2GFPexpressionofNCI-H460withdifferentcellsconcentrationsinvitroobservedbyinvivobiofluoresentimagingsystem(A)Pseudo-colorimageofNCI-H460-GFPcellswithdifferentcellsconcentration.(B)ReferenceimageofdimensionaldistributionandrelativeamplitudeoffluorescencedrownbyWinlight32software.(C)QuantificationoffluorescenceofNCI-H460-GFPcells.2.3活体荧光成像动态观察NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生长NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生长潜伏期约5天，1周时肿瘤大小不能用游标卡尺测量，2周时肿瘤进入对数生长期，至5周时移植瘤体积可达（3782.00±852.89）㎜3，4只动物皮肤表面都出现了不同程度的坏死。应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第4周，随着肿瘤