促红细胞生成素对早产儿外周血循环中造血祖细胞的作用

促红细胞生成素对早产儿外周血循环中造血祖细胞的作用肖娟王丹华刘艳云汪玄中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院儿科，血液科中华围产医学杂志2009年1月第12卷第1期摘要目的研究促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）治疗早产儿贫血的安全性及有效性，并对其治疗早产儿贫血的内在机制进行探讨。方法对24例贫血早产儿进行随机对照的前瞻性研究，治疗组和对照组各12例。治疗组除采用对照组的常规疗法外，令给予EPO250U/(kg·次)，3次/周，皮下注射，共4周。EPO治疗前及治疗2周时应用半固体培养的方法分别对两组外周血中各系造血祖细胞形成的集落数进行比较分析，并对治疗期间的白细胞总数、中性细胞绝对值、淋巴细胞数、单核细胞数、血小板数及网织红细胞、血红蛋白等进行比较。结果EPO治疗前治疗组与对照组的红集落形成单位、红系爆式集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位、混合集落形成单位和巨核细胞集落形成单位的集落数差异无统计学意义（P＞0.05）。而治疗2周时，治疗组红集落形成单位为（57±20）个，明显高于对照组[（34±13）个]（P0.05）；治疗组与对照组相比较，治疗期间白细胞总数、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞数、单核细胞数及血小板数均无明显的变化（P0.05），而治疗组治疗1、2、3、4周后，网织红细胞数及血红蛋白均有显著提高（P＞0.05）；治疗第4周时，治疗组的血红蛋白高于对照组[（152±14）g/L，（128±11）g/L，P0.05）]。结论从祖细胞水平及临床水平均证明了EPO治疗早产儿贫血的安全性及有效性。EPO可能作用于早产儿的红系晚期造血祖细胞及其以后阶段，进而使血红蛋白升高。关键词婴儿，早产，疾病；贫血；造血干细胞；红细胞生成素所有早产儿在生后前几周均会出现不同程度的血红蛋白下降，而且出生体重越低，贫血程度越严重，持续时间也越长。早产儿贫血传统的治疗方法是输血，但输血存在潜在危险性。国内外已有应用促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）治疗早产儿贫血的报道。EPO可促使更多的多能干细胞定向向红系造血祖细胞转化，进而生成成熟的红细胞，从而使外周血网织红细胞（reticulocyte，Rte）及血红蛋白（hemoglobin，Hb）明显提高。但同时对多能干细胞的竞争可能使粒细胞减少，从而导致中性粒细胞减少或缺乏症。Halpérin发现临床中应用EPO后出现暂时性中性粒细胞下降及血小板数上升，临床上有使感染、血栓增多的趋势。那么，EPO究竟作用于早产儿的多能造血干/祖细胞还是红系祖细胞？如何使Hb上升？是否导致感染机会增加？是否导致血栓形成的机会增加？本研究从造血祖细胞水平研究EPO的作用，并对其防治早产儿贫血的内在机制进行了探讨。资料与方法一、研究对象研究对象为2002年1月至2005年12月在我院住院的早产儿。入选标准：胎龄＜34周、体重＜1800g的早产儿。排除标准：（1）研究期间需要机械通气或持续气道正压辅助呼吸或吸入氧浓度＞40%者。（2）不能坚持完成EPO4周疗程者。治疗组共募集早产儿16例，4例因未完成4周EPO疗程推出研究。研究对象均在生后3～11d内随机分组，最终每组12例。治疗组应用EPO，对照组不用EPO。二、方法1.EPO的使用：治疗组EPO250U/（kg·次），3次/周，皮下注射，共4周。同时口服硫酸亚铁，开始为元素铁2mg/（kg·d），逐渐增至6mg/(kg·d)；VitE5mg，Bid;叶酸0.5mgQd;VitB12100μg，肌注，1次/4周。对照组除不用EPO外，其余与治疗组相同。2.造血祖细胞培养：分别于用药前及开始用药后2周时做造血祖细胞的培养。培养方法：（1）单个核细胞分离：研究对象取静脉血1～1.5ml肝素抗凝，适当PBS稀释后叠加于Ficoll淋巴细胞分离液（比重1.077）上，400r/min离心25min，吸取单个核细胞层，PBS洗涤2次后备用。（2）甲基纤维素半固体培养：培养基的准备参照文献，IMDM培养基终浓度：30%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、0.9%甲基纤维素、干细胞因子50ng/ml、EPO2.5U/ml、粒-巨噬细胞集落刺激因子40ng/ml和白细胞介素-3(interleukin-3，IL-3)50ng/ml。上述培养基及上述分离的单个核细胞1×105/ml混匀后加入24孔板中（0.3～0.5ml/孔），每份标本重复两孔。将培养体系置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。于倒置显微镜下计数集落，按其形态辨认不同类型的集落。红系集落形成单位（colo-nyformingunit-erythroid，CFU-E）（＞7个细胞的细胞团）在培养第5～7天时计数。红系爆式集落形成单位（burstformingunit-granulocyte/macrophage，CFU-GM）(＞40个细胞的细胞团)及混合集落形成单位（colonyformingunit-Mix，CFU-Mix）(＞50个细胞的细胞团)在第10～14天时计数。部分集落以10μl加样枪吸出涂片做瑞士染色以明确集落的类型。（3）巨核细胞集落形成单位（colonyformingunit-megakaryocyte，CFU-MK）应用血浆凝块体系进行。上述分离的单个核细胞1×105/ml加入IMDM体系（10%牛血浆、10%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、0.34mg/mlCaC12、50ng/ml促血小板生成素和20ng/mlIL-3）。经过12～14d培养后，培养基自然风干、固定，以CD61-FITC的单抗进行荧光染色，然后在荧光显微镜下计数CFU-MK（≥3个细胞的细胞团）。3.检测指标：于用药前及开始用药后4周内每周测定1次血常规及网织红细胞，共5次。白细胞、红细胞及血小板数通过自动血细胞计数仪测定，中性粒细胞绝对值通过WBC总数及血涂片中中性粒细胞数所占比例计算得出。三、统计学分析应用统计软件SPSS10.0进行分析。正态分析布计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。结果一、研究对象的基本情况两组早产儿的出生体重、胎龄、入组日龄以及血常规中各项指标，包括：Ret、Hb、WBC、中性粒细胞绝对值及PLT等的差异均无统计学意义（表1），两组具有可比性。二、两组在治疗开始前及治疗2周时外周血造血祖细胞数（或形成集落数）的比较早产儿外周血循环中不仅含有一定数量的CFU-GM及CFU-E、BFU-E，也含有一数量的CFU-Mix。治疗2周时，治疗组的CFU-E明显高于对照组，差异有统计学意义。见表2。三、两组在治疗第1、2、3、4周时血细胞计数的比较在4周治疗过程中，治疗组与对照组的白细胞总数、淋巴细胞数及中性粒细胞绝对值的差异均无统计学意义。见表3。四、两组在治疗第1、2、3、4周时血小板数及网织红细胞、血红蛋白数值的比较在4周治疗过程中，治疗组与对照组血小板数差异无统计学意义。治疗组Ret及Hb均比对照组明显提高，差异有统计学意义。见表4。讨论早产儿贫血常发生于出生后4～8周的早产儿，尤其是极低出生体重儿贫血发生的更早，程度也更重，严重影响早产儿的生活质量。EPO的应用翻开了早产儿贫血治疗的新篇章。本研究从造血祖细胞水平及临床水平评价了EPO治疗早产儿贫血的安全性和有效性。表1两组患儿在研究开始时的临床及实验室资料比较（x±s）组别例数出生体重(g)胎龄（周）进组日龄（d）Ret(%)Hb(g/L)WBC(×109/L)中性粒细胞(×109/L)淋巴细胞(×109/L)PLT(×109/L)治疗组对照组12121200±531178±5331.7±0.421.8±0.58.6±1.59.4±1.21.5±0.71.8±0.5158±21155±2412.4±3.012.9±3.67.7±2.08.1±2.24.3±0.74.5±0.6195±48201±51t值P值0.740.48-0.380.72-1.020.24-0.850.430.230.82-0.260.80-0.330.75-0.530.61-0.210.84表2两组患儿在治疗开始明及治疗2周时外周血形成集落数的比较（x±s,个）组别例数CFU-MKCFU-GMCFU-EBFU-ECFU-Mix治疗前2周治疗前2周治疗前2周治疗前2周治疗前2周治疗组对照组121212±910±818±1214±1356±1948±1249±1843±1465±2159±2457±2034±1338±1531±1233±1421±133±12±14.0±13.0±1t值P值0.410.690.190.850.630.440.610.560.410.703.360.0150.840.411.440.791.730.571.190.18表3两组患儿在治疗1、2、3、4周时血细胞计数的比较（x±s,×109/L）组别例数白细胞白细胞白细胞1周2周3周4周1周2周3周4周1周2周3周4周治疗组对照组121213.3±2.511.7±2.212.2±1.712.5±1.412.8±1.611.9±1.311.7±1.412.3±1.55.4±1.44.8±0.95.8±0.85.1±0.56.2±1.05.7±0.66.8±0.97.1±0.89.2±0.99.7±1.18.5±1.29.2±0.54.7±0.44.5±0.24.9±0.64.8±0.5t值P值0.870.44-0.060.940.830.56-0.90.841.240.491.670.471.160.68--0.430.96-0.730.49-0.940.381.260.230.360.73表4两组患儿在治疗第1、2、3、4周时PLT及Ret、Hb的比较（x±s,×109/L）组别例数白细胞白细胞白细胞1周2周3周4周1周2周3周4周1周2周3周4周治疗组对照组1212210±36198±41233±52215±48254±56227±62271±63229±683.8±0.41.5±0.34.6±0.51.8±0.64.9±0.71.0±0.63.9±0.80.9±0.7167±25141±18169±22138±15159±17132±13152±14128±11t值P值0.1250.900.550.610.570.591.050.3310.870.038.780.02410.360.0153.130.022.210.0492.840.033.350.0153.720.021血细胞的增殖分化是在一系列细胞因子的调节下完成的，其中与红细胞发育成熟关系密切的是EPO。EPO的合成释放受多种因素调节和控制，其中组织缺氧是刺激EPO合成释放的主要因素。动物实验收报告和临床研究发现，早产儿贫血期间，血中EPO浓度增加明显低于成人或儿童同等程度贫血者水平，而且胎龄越小，EPO浓度越低。目前认为这可能与EPO产生的部位有关。动物实验表明，哺乳类动物在宫内最先由肝脏产生EPO，在胎龄30周时开始逐渐向肾脏转移，这种转移大约在生后40d完成。极低出生体重儿由于发育不成熟，生后前几周产生部位主要在肝脏，而肝脏对缺氧较肾脏不敏感，因此产生EPO较少。本研究显示给予EPO治疗后，早产儿循环池中红系晚期细胞CFU-E较对照组明显增多，说明早产儿贫血是由于EPO产生不足而非红系祖细胞对EPO反应异常所致，从而为临床上应用EPO治疗早产儿贫血提供了理论依据。本研究发现早产儿循环池中确实存在一定数量的CFU-Mix、CFU-MK、BFU-E、CFU-E及CFU-GM、CFU-Mix的数量表示尚未定向的多能干细胞或多能祖细胞数，BEU-E表示早期红系祖细胞数，CFU-E表示晚期红系祖细胞数，CFU-GM表示粒-巨噬祖细胞数，CFU-MK表示巨核系祖细胞数，而各阶段红系祖细胞的存在为EPO作用于各阶段细胞的研究奠定了基础。成熟红细胞是由造血干细胞分化增殖而来。干细胞先形成CFU-Mix，然后定向为BFU-E，分化成CFU-E，