光合细菌研究进展

光合细菌研究进展摘要:光合细菌分布广泛，本身无毒，富含蛋白质、类胡萝卜素等多种营养物质，得到广泛应用。光合细菌的分子生物学研究已开展了40多年，在固碳和蛋白质表达系统研究方面取得了丰硕成果。阐述了光合细菌cbb操纵子固碳的分子机制和光合细菌作为新型蛋白质表达系统的研究进展，提出了未来的研究重点，为光合细菌的综合开发和利用提供了新思路。关键词:光合细菌;固氮;CbbR转录蛋白;表达系统光合细菌分布广泛，遍及江河、沼泽、湖泊和海洋等，具有固氮、制氢、固碳、脱硫等作用［1］。光合细菌生命力强，容易培养，生长繁殖速度快，本身无毒，富含蛋白质、维他命、类胡萝卜素等［1-2］。光合细菌发现于19世纪30年代，直到20世纪70年代才进行了深入、广泛的研究，极大地推动了光合细菌的研究［3］。目前，光合细菌在固碳和蛋白质表达系统等方面的研究取得了丰硕的研究成果。1光合细菌固碳研究光合细菌生命力旺盛，能够以好氧、厌氧和光合异养等多种方式生长，在其生长代谢过程中伴随固碳作用。光合细菌对二氧化碳的固定是通过卡尔文(Calvin－Benson－Bassham，CBB)循环，即戊糖磷酸途径实现［1］。光合细菌在自养生长条件下，CBB循环中的关键酶可以得到诱导表达，如核酮糖－1．5－二磷酸羧化酶/加氧酶和磷酸核酮糖激酶。在光合异养条件下，二氧化碳的固定能力是不固定的，与电子受体的还原势能有关［4］。电子受体如二甲亚砜DMSO能够抑制CBB循环酶的生物合成，从而失去固定二氧化碳的能力［5］。同时，光照强度能够增强光合细菌固碳的能力［6］。光合细菌固碳对其生长和分泌有机酸以及捕光色素蛋白复合体、细菌叶绿素的生物合成都有一定的影响［7］。光合细菌对二氧化碳的固定受到cbb(CBB循环中的关键酶结构基因)操纵子的严格调控，cbb操纵子包括cbbI和cbbII两个操纵子，分布在基因组的不同位置，表达受CbbR转录蛋白的激活［8］。cbbI操纵子编码CBB循环中的关键酶，主要包括cbbFI、cbbPI、cbbAI和cbbLIcbbSI基因。cbbFI基因编码果糖－1，6－景天庚酮糖－1，7－二磷酸酶、cbbPI基因编码磷酸核酮糖激酶、cbbAI基因编码果糖－1，6－景天庚酮糖－1，7－二磷酸醛缩酶、cb-bLIcbbSI基因编码核酮糖－1.5－二磷酸羧化酶/加氧酶［9］。cbbII操纵子除编码ccbI操纵子中cbbFI、cbbPI和cbbAI基因编码的关键酶的同功酶，其中的cbbTII基因编码转酮醇酶、cbbGII基因编码甘油醛－3－磷酸脱氢酶、cbbMII基因编码II－型核酮糖－1.5－二磷酸羧化酶/加氧酶亚基［10］。cbbI操纵子的表达受转录蛋白CbbR的激活，同时也受RegA/RegB双组分信号转导系统中RegA蛋白的调控［8，11］。cbbR基因位于cbbFI基因的上游，DNaseI印迹分析表明CbbR转录蛋白结合到cbbI操纵子启动子转录起始位点的－10bp和－70bp区之间。DNaseI印迹也证明了RegA转录蛋白也能结合到cbbI操纵子启动子区域，存在两个DNA结合位点，一个位于启动子调节区的－301bp和－415bp区域之间，另一个与CbbR蛋白结合位点重叠。RegA和CbbR蛋白自身能够形成四聚体，RegA蛋白能够促进CbbR蛋白与启动子的结合，但RegA与启动子的结合不需要CbbR蛋白的参与［12］。研究表明，CbbR和RegA蛋白对cbbI操纵子的调控需要RuBP蛋白的参与，RuBP能促进CbbR和RegA蛋白的相互作用和增强CbbR蛋白与启动子的结合［13-14］，如图1所示。其中，CbbR、RegA与RuBP蛋白共同作用才能使得cbbI操纵子基因转录，在缺少RuBP蛋白的情况下，CbbR和RegA蛋白不能调控cbbI操纵子基因的表达。目前，常见用于固碳研究的光合细菌有类球红细菌Rhodobacter(R．)sphaeorides、荚膜红细菌Rhodobacter(R．)capsulatus和沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas(R．)palustris。R．sphaeoridesCbbR转录蛋白的大小约为33.2KDa，R．capsulatusCbbR1和CbbR2转录蛋白的大小分别约为31.77KDa和33.7KDa，R．palustrisCbbR转录蛋白的大小约为35.09KDa。利用DNAMAN软件分析CbbR序列表明CbbR蛋白具有相对较高的保守性，如图2所示。其中，荚膜红细菌R．capsulatusCbbR1和CbbR2转录蛋白的绝对同源性达到36.31%。图中黑色框代表RegA蛋白DNA结合位点，白色框代表CbbR蛋白DNA结合位点。图1CbbR、RegA蛋白对cbbI操纵子表达的调控模式图中R．capsulatusSB1003－1和R．capsulatusSB1003－2分别表示荚膜红细菌R．capsulatusSB1003CbbR1和CbbR2转录蛋白。图2CbbR转录蛋白的保守性分析cbbII操纵子的表达也受转录蛋白CbbR和RegA的调控，与cbbII操纵子的调控有所不同［15-16］。DNaseI印迹分析表明，CbbR转录蛋白的DNA结合位点位于cbbII操纵子启动子的+38bp和－227bp区域之间，但CbbR转录蛋白对cbbII操纵子的调控能力比较弱。RegA蛋白在启动子的－227bp和－1025bp区域之间存在4个DNA结合位点，在光合细菌任何生长条件下都能提高cbbII操纵子的表达。而ReA转录蛋白在cbbI操纵子启动子的－227bp和－545bp区域之间仅存在一个能够提高cbbI操纵子表达的结合位点。此外，RegA蛋白对cbbII操纵子的调控比CbbR蛋白更为重要。2光合细菌蛋白表达系统研究光合细菌具有表达膜蛋白的天然优势，自身含有丰2四川理工学院学报(自然科学版)2012年10月富的膜蛋白［17］。光合细菌参与光合作用的蛋白多数属于膜蛋白，如捕光色素蛋白复合体1(LH1)、LH2、光化学反应中心(RC)、类胡萝卜素和细菌叶绿素生物合成的结构蛋白和调控蛋白等，它们的含量达到光合细菌总膜蛋白含量的50～70%。编码这些蛋白的基因非常有规律地分布在染色体I。这些参与光合作用的膜蛋白分布在光合细菌的ICM(Intracytoplasmmembrane)系统中。此外，光合细菌基因组完全测通，遗传背景和调控机制清楚［18-19］。张世静等［20］等对光合细菌研究表明其具有较高的安全性。目前，用于异源表达蛋白质的光合细菌主要有R．sphaeorides、R．capsulatus、脱氮副球菌Para-coccusdenitrificans和深红红螺菌Rhodospirillumrubrum等。Graichen等［21］于1999年成功利用R．sphaeroides成功表达了具有良好的生物活性的甲胺脱氢酶。Laible等［22］于2004年利用R．sphaeroides和puf操纵子成功表达了APC809和APC951两种膜蛋白。Roy等［23］于2008年成功利用R．sphaeroides和puf操纵子基因表达了的人G－蛋白受体GPCRs，放射性配体结合试验分析表明纯化的GPCRs具有良好的活性，这为利用光合细菌表达膜蛋白奠定了坚实的基础。2009年，Ind等［24］以pIND4为骨架载体并结合pYanni3的lacIq调控基因、pMG160复制子和pJBA24的lac启动子PA1/04/03构建了光合细菌表达载体，并利用R．sphaeroides和Paracoccusdenitrificans表达了光合细菌CheY6蛋白。其中，CheY6蛋白在R．sphaeroides中的表达量达到2.3mg每升细菌，在Para-coccusdenitrificans中的含量达到1.3mg每升细菌。该研究为商业化光合细菌表达载体的构建提供了理论和实践依据。2010年，Butzin等［25］利用Rhodospirillumrubrum表达了PseudomonasaeruginosaMscL和CycB膜蛋白、StreptomyceslividansKcsA膜蛋白，它们在每升细菌中的表达量分别达到22.8～23.4mg、6.7～7.4mg和13.7～14.4mg。2010年，Haz等［26］利用大肠杆菌乳糖操纵子基因和R．sphaeroidespuc操纵子启动子pucP构建了光合细菌用表达载体，该表达载体含有受外源IPTG和氧气浓度调控的杂合启动子，首次实现了对外源蛋白表达的精确调控;首次建立了一步法从R．sphaeroides中纯化蛋白质的方法技术体系［27］。2011年，Zhaoz等［2］利用R．sphaeroides和puc操纵子建立了新型蛋白异源表达系统并表达了人α防御素－3、GFP等多个具有生物活性的蛋白质，极大地推动了光合细菌新型蛋白质表达系统的发展和开发利用。以上光合细菌表达系统都是基于ICM系统建立，如图3所示。光合细菌自身膜蛋白和表达的外源蛋白质都将通过puc操纵子PucC蛋白的装配作用进入ICM系统［28］。R．capsulatus也有望开发成为一种理想的蛋白质表达系统［29］，2002年，Kappler和McEwan利用R．capsulatus和pDorEX表达载体表达了的细胞色素C氧化还原酶［30］。2005年，Drepper等［31］利用R．capsulatus和T7启动子表达了氢化酶。2010年，Katzke等［32］利用R．capsulatus和T7启动子表达了黄色荧光蛋白YFP，实验证明YFP在R．capsulatus和大肠杆菌中表达量都达到了80mg/L。继续优化光合细菌表达载体和表达宿主，提高外源蛋白质表达水平，利用光合细菌表达具有重要生物学功能的蛋白质将是今后研究的重点。图3光合细菌ICM系统示意图3展望目前，虽然光合细菌在蛋白质表达系统研究方面取得了较多成果，但仍需进一步开发与完善，主要集中在表达载体和表达宿主的优化。光合细菌在固碳方面的研究取得的进展为其应用奠定坚实的理论基础。利用光合细菌固碳、固氮的原理处理污水将是未来光合细菌应用研究的一个重要领域。此外，光合细菌已成为现代生物技术研究的重点，在诸多方面得到了一定的应用，如生物制氢、生物医药、保健品、水产养殖等［33］。随着光合细菌分子生物学研究的发展，光合细菌将会得到越来越广泛的应用。参考文献:［1］WuJ，BauerCE．RegB/RegA，aglobalredox-re-spondingtwo-componentsystem［J］．AdvExpMedBiol，2008，631:131-148．［2］ZhaoZ，HuZ，NieX，etal．AnovelRhodobactersphaeroidesexpressionsystemforreal-timeevaluationofheterologousproteinexpressionlevels［J］．ProteinPeptLett，2011，18(6):568-572．第25卷第5期赵志平等:光合细菌研究进展3［3］ImhoffJF，PetriR，SulingJ．Reclassificationofspe-ciesofthespiral-shapedphototrophicpurplenon-sul-furbacteriaofthealpha-Proteobacteria:descriptionofthenewgeneraPhaeospirillumgen．nov．，Rhodovibriogen．nov．，Rhodothalassiumgen．nov．andRoseospiragen．nov．aswellastransferofRhodospirillumfulvumtoPhaeospirillumfulvumcomb．nov．，ofRhodospiril-lummolischianumtoPhaeospirillummolischianumcomb．nov．，ofRh