生化工程,第二章酶促反应动力学

任课教师：郑志永副教授高敏杰博士联系方式：13915290760电话：[phone]邮箱：[e-mail]生化工程第二章均相酶催化反应动力学Lysozyme《生化工程》BiochemicalEngineering3•脂肪酶催化酯化反应:生物柴油油料甘油＋脂肪酸实例•高果糖浆:α-淀粉酶糖化酶葡萄糖异构酶淀粉浆液糊精葡萄糖果糖甲醇NaOH生物柴油4化学反应的基础知识•反应进行的方向•反应进行的可能性•反应进行的限度•反应进行的速率•反应机制化学热力学化学动力学5反应速率及其测定•反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变。•设瞬时dt内反应物浓度的很小的改变为dS，则：•若用单位时间内生成物浓度的增加来表示，则：tSvddtPvddtPtvtPvdd6反应分子数•反应分子数：是在反应中真正相互作用的分子的数目。•如：A→P属于单分子反应•根据质量作用定律，单分子反应的速率方程式是：•双如：A＋B→C＋D属于双分子反应•其反应速率方程可表示为：•判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，必须先了解反应机制，即了解反应过程中各个单元反应是如何进行的。•反应机制往往很复杂，不易弄清楚，但是反应速率与浓度的关系可用实验方法来确定，从而帮助推论反应机制。]A[kv]B][A[kv7反应级数又如某一反应：A+B→C+D]][[kvBA式中k为反应速率常数根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。例：对于某一反应其总反应速率能以单分子反应的速率方程式表示，那么这个反应为一级反应。符合双分子反应的表达式，为二级反应。8把反应速率与反应物浓度无关的反应叫做零级反应。v=k[A]0•反应分子数和反应级数对简单的基元反应来说是一致的，但对某些反应来说是不一致的。例如：•Sucrose+H2O─→Glucose+Frucose•是双分子反应，但却符合一级反应方程式。Sucrase因为蔗糖的稀水溶液中，水的浓度比蔗糖浓度大得多，水浓度的减少与蔗糖比较可以忽略不计。因此，反应速率只决定于蔗糖的浓度。v=k[S]9酶促反应动力学基础－反应速率零级反应一级反应A─→B积分后得：这儿：k是反应速率常数，C是积分常数若反应开始(t=0)时,A=A0,则C=lnA0,最后得到:A=A0e-ktmaxd][drtSvkAddAtvkCkAlntAtA0tddA一级反应10二级反应A+B─→CABvkkk指反应的速率常数。反应速率与反应物的性质和浓度、温度、压力、催化剂及溶剂性质有关11酶促反应动力学基础－平衡常数•平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继续进行，但反应速率相等的动态过程。•反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及产物浓度有关。•平衡常数(K)的计算：例：A+3B2C+D32BADCK12酶的基本概念酶有很强的专一性较高的催化效率反应条件温和酶易失活酶可加快反应速率降低反应的活化能(Ea)不能改变反应的平衡常数K不能改变反应的自由能变化(ΔG)13酶促反应动力学基础影响酶促反应的主要因素浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等）外部因素（温度，压力，pH，溶液的介电常数，离子强度等）内部因素（效应物，酶的结构）14酶与底物的作用机理•LockandKeyModel15Induced-FitModel•手与手套的关系.•当底物接近酶的活性中心并与之结合时，酶的构象能发生改变，更适合于底物的结合。16酶反应动力学酶反应动力学的两点基本假设：反应物在容器中混合良好反应速率采用初始速率17＋k+1k-1ESES＋E单底物酶促反应动力学k+2快速平衡学说的几点假设条件：1.酶和底物生成复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。2.底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。3.不考虑P+E→ES这个可逆反应的存在。4.[ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。P18＋k+1k-1ESES＋Ek+2快速平衡学说][d][dESktPvP2由假设3可得到产物的合成速率为：对于单底物的酶促反应:(2)00ttdtdSdtdP(1)P][]][[ESkSEk11由假设4可得到：19对于酶复合物ES的解离平衡过程来说，其解离常数可以表示为,][]][[ESSEkkKS11ESE+Sk-1k+1(4)][][][ESEE0反应体系中酶量守恒：(3)由前面的公式(1)得：代入公式(3),变换后得：][][][11-SkESkE110kkSSEES][]][[][即,SK][]][[][SSEES0代入公式(2)得到SK][]][[SSEkvP02(5)20][][][]][[d][dmaxSKSVSKSEktPvSPSP02代入式(5)得：(6)式中：Vp,max:最大反应速率如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。KS:解离常数，饱和常数低KS值意味着酶与底物结合力很强，(看看KS的公式就知道了)。][max02EkVP当反应初始时刻，底物[S][E],几乎所有的酶都与底物结合成复合物[ES]，因此[E0]≈[ES],反应速率最大，此时产物的最大合成速率为：21＋k+1k-1ESES＋Ek+2稳态学说P稳态学说的几点假设条件：1.酶和底物生成复合物[ES]，酶催化反应是经中间复合物完成的。2.底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。3.在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+E→ES这个可逆反应的速率极小，可以忽略不计。4.[ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。22Experimentaldatademonstratedtheconcentrationprofiles.当反应系统中[ES]的生成速率与分解速率相等时，[ES]浓度保持不变的状态称为稳态。230dtESd][由于[S][E0],所以[S][ES],[S]-[ES]≈[S]＋k+1k-1ESES＋Ek+2P根据稳态假说，0211][][]][[d][dESkESkSEktES][][][ESEE0(7)][]][[][SkkkSEES1210(3)(8)24][d][d2ESktPvP][][][]][[d][dmaxSKSVSkkkSEktPvmPP1210212121kkKkkkKSm][max02EkVP(Km米氏常数)(9)(10)式中：Michaelis-Menten25项目快速平衡学说稳态学说酶和底物生成不稳定复合物[ES]，酶催化反应是经该中间复合物完成的，即：E+S[ES]E+P[ES]在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡11kkKS[ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化0dd][tCES假设底物浓度远高于酶的浓度。CSCE酶量守恒CE0=CE+C[ES]产物生成速率]ES[2d][dCktP动力学方程][][d][dmaxSKSVtPSP][][d][dmaxSKSVtPmPKS与Km11kkKS121kkkKSk+1k-1k+2m26快速平衡学说与稳态学说在动力学方程形式上是一致的，但Km和KS表示的意义是不同的。当k+2k-1时，Km=KS这意味着生成产物的速率远远慢于[ES]复合物解离的速率。这对于许多酶反应也是正确的。MixedorderwithrespecttoS27反应速率、底物浓度与时间的关系S,E0369120.00.30.60.90.000.050.100.15vSSubstratetime28底物浓度与反应速率的关系0.00.40.80.000.060.120.180.24vS,mvS(mmol/L/h)S(mmol/L)vS,maxKm底物浓度反应速率mV21Vm29反应速率、底物浓度与时间的关系0246810120.000.050.100.150.20vS(mmol/L/h)time(h)反应速率反应时间0246810120.00.20.40.60.81.01.2S(mmol/L)time(h)底物浓度反应时间30米氏常数Km的意义Km值代表反应速率达到Vmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH和离子强度等因素会影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。Km值可以判断酶的专一性和天然底物。当k+2k-1时，Km＝KS，那么Km可以作为酶和底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合的亲合力大小。若已知Km值，可以计算出某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。例如:当[S]=3Km时，代入米氏方程后可求得v=0.75VmaxKm值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，例如谷氨酸脱氢酶，NAD+的Km值为2.5×10-5mol/L，而NADH为1.8×10-5mol/L。测定这些Km值的差别及正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率。31问题为什么说低Km值意味着酶与底物的结合力强？考虑一下Km的定义：为什么只有初始反应速率可以使用？12121kkKkkkKSma.产物的积累使逆反应的影响不可忽略b.产物可能会抑制或激活酶的活力c.随着反应的进行，酶的活力可能会失活d.反应体系中的一些杂质可能会影响到酶的活性e.…….3200][][ttinitdtSddtPdv实验测定Michaelis-Menten动力学参数根据已知的[S0]和[E0],能计算出初始的反应速率:33动力学参数的求解作图法(通过方程变换，将方程线性化)L-B法H-W法E-H法积分法非线性最小二乘法回归处理信赖域法(Matlab的优化工具箱)遗传算法(不依赖于初值，可并行计算)34L-B双倒数法•将米氏方程式两侧取双倒数，得到下列方程式：•以作图,得到一直线•缺点：实验点过分集中在直线的左下方，影响Km和Vmax的准确测定。maxmax][VSVKvm111[S]11对vv1][1SmaxV1mK135积分法分批酶反应体系中[S]随时间的变化过程可以用表示为：][][][SKSVdtSdvmmS积分得到,][][ln][][00SSKSStVmm或,与对应作图，得到一直线，斜率为-Km,截距为Vm][][ln10SSttSS][][0][][ln1][][00SStKVtSSmm36Thedatabelowwasfromanenzymeactivitydetermination.1.[S]3μM------------v=10.4μmol/min2.[S]5μM------------v=14.5μmol/min3.[S]10μM-----------v=22.5μmol/min4.[S]30μM-----------v=33.8μmol/min5.[S]90μM-----------v=40.5μmol/minQuestion:a).whatisthevalueofVmaxandKm?B).makeadoublerecripocalplot(Lineweaver-Burk)1/vvs1/[S].实例37抑制剂对酶促反应速率的影响几个概念失活与抑制【失活】(inactivation)：由于酶蛋白分子变性而引起的酶活力丧失的现象称为失活。【抑制】(inhibition)：由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失，称为抑制作用底物与效应物【效应物】(Effecte