中药成分测定方法.

1第四章中药的含量测定2第一节含量测定的目的与意义•中药的含量测定与化药有很大区别•中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，检测任何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效。•但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有效成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于控制中药质量起着不可替代的重要作用。•通过测定中药中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药的质量，达到临床用药安全、有效的目的。3第二节含量测定样品的处理样品处理的主要作用有：将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。4第二节含量测定样品的处理一、样品的粉碎1.目的：①是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；②是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。2.粉碎时注意事项：①不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。②避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原因而玷污样品，③防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。④过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，让其全部通过筛孔。5第二节含量测定样品的处理二、样品的提取对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。常见的提取方法：冷浸法回流提取法连续回流提取法超声提取法超临界流体提取法6第二节含量测定样品的处理三、样品的分离净化（一）沉淀法（二）蒸馏法（三）液一液萃取法（LLE）（四）色谱法7第二节含量测定样品的处理（四）色谱法吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液—固萃取（LSE）具有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做一简介。LSE通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长5`～15cm，内径0.5～1cm的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的样品进一步用GC、HPLC、TCL分离后测定。LSE的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8、C18、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。8第二节含量测定样品的处理⒈硅胶、氧化铝等：它们是传统的吸附剂，多以0.07～0.15mm(200～100目)的颗粒1～5g用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂的样品加到柱上时非极性或低极性的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如用ＵＶ法（吸收系数法）硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分分离。9⒉键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（简称C18或ODS）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类LSE的一般操作程序为：1)柱的活化。用2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.5毫升水洗去柱中的甲醇。2)上样。3)清洗。用2～5ml的水清洗以除去弱保留的亲水成分，如无机盐、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。4)洗脱。用2～5ml甲醇或甲醇-水洗脱大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强保留的待测组分。第二节含量测定样品的处理10⒊大孔树脂：它可分为极性和非极性型极性丙烯酰胺聚合物;非极性苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表面积极大，传质速率较高和具有不同的极性及适于吸附较大分子。树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为1～2g，有时也用100～150mg来萃取血、尿中药物，操作程序类似ODS填料。第二节含量测定样品的处理11第二节含量测定样品的处理⒋聚酰胺：它是常用的有机吸附剂，主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用。常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离，如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以95%乙醇洗脱总黄酮后测定。12第二节含量测定样品的处理⒌硅藻土、纤维素：它们为常用的亲水型填料，其原理为分配作用。填料作为支持剂，多以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被洗脱，达到萃取的目的。其萃取率较高（一般大于80%），无浓集作用，萃取液较纯净，但洗脱剂用量较大（一般大于5ml）硅藻土柱则用干柱直接上样，柱可再生。常见牌号为Extretut。纤维素柱的使用与硅藻土柱相似。13⒍离子交换树脂：憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的有机溶剂。离子交换树脂柱可用于除去样品中的离子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中可离解化合物。第二节含量测定样品的处理14第二节含量测定样品的处理此外，近年来发展起来的固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技术有良好的应用前景。SPME是一种无溶剂的萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。15（五）消化法对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。⒈湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消化方法。（1）硝酸—高氯酸法该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。（2）硝酸—硫酸法该法适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。第二节含量测定样品的处理16第二节含量测定样品的处理（3）硫酸—硫酸盐法本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分解为SO3而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进行。17第二节含量测定样品的处理⒉干法消化本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。应用本法时要注意以下几个问题：1）加热灼烧时，控制温度在420℃以下，以免某些被测金属化合物的挥发。2）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。18第三节常用定量分析方法分类重量分析和滴定分析。化学分析法所用仪器简单，结果准确。主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。19第三节常用定量分析方法（一）重量分析法重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：①供试品的干燥失重测定；②水分测定均属挥发法；③中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。2、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如①冰硼散中冰片的含量测定；②地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；③昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；④甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取法。3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如①西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；②苦参片中苦参总碱的含量测定；③复方元胡注射液总碱的测定。20第三节常用定量分析方法（二）滴定分析法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。1、酸碱滴定法适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。①直接滴定：对于K·C≥10-8的酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠茄酊中生物碱的含量测定。②间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。2、沉淀滴定法主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测定。21第三节常用定量分析方法3、配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。如①万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；②牛黄解毒片中石膏的含量测定。4、氧化还原滴定法适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及矿物药Fe、As等成分的中药制剂。如①磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；②牛黄解毒片中雄黄的含量测定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的含量测。22第三节常用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法,具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。该法要求被测成分本身或其显色产物对可见—紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。23第三节常用定量分析方法（一）单波长光谱法分类方法特点吸收系数法测定所配供试品溶液在规定波长的吸收度，根据被测成分的吸收系数（E1%1cm）计算其含量①对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收的校正，吸收度准确度的检定和杂散光的检查②无需对照品，方法简便对照品比较法在同样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成分的量应为后者中被测成分的量的100%±10%，用规定波测定二者的吸收度，则可计算出供试品中被测成分的浓度或含量对仪器要求较高标准曲线法配制一系列不同浓度的对照品溶液（常为5个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制A-C曲线，或求出其回归直线方程（相关系数r≥0.999），即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液的吸收度，就可求得供试品中被测成分的浓度或含量。①本法对仪器的精度要求不高，有时标准曲线不通过原点，只要重现性好也可使用②该法在比色法中最常用24第三节常用定量分析方法（二）多波长光谱法（计算分光光度法）供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定