临床生化检验应用工程师基础知识培训

临床生化检验基础知识培训一、生化基础知识1.1生化诊断试剂盒为由一定的化学品或者酶类组成的多成分混合试剂（Reagent），最终以水溶液的方式与待测物发生一系列化学或者生化反应，通过生成物或反应物中某物质的吸光度变化，测量待检测物中某种特定物质的含量。1.2生化诊断试剂用于检测样本，包括：人体血清（主要）、血浆及尿液中的各种酶类和代谢产物，用于预测，诊断以及治疗监测，协助临床医生诊治疾病提供数据参考。1.3按功能分为：肝功、血脂、肾功、心肌、代谢、免疫&风湿、离子&其他。1.4试剂性能评价指标：1试剂外观2批间差3准确度4精密度5线性（灵敏度）6抗干扰能力（特异性）7稳定性1.5试剂检测原理（朗伯比尔定律）：A=Kbc式中，A为吸光度;K为吸收系数，是与入射辐射的波长及吸收物质的性质有关的常数;b为液层厚度，单位为cm;c为吸收物质的浓度。当浓度的单位为mol/L时，K的单位为L/mol·cm，称为摩尔吸收系数，通常用ε表示。摩尔吸收系数ε表示物质对某一波长的辐射的吸收特性。ε愈大，表示物质对某波长辐射的吸收力愈强，因而分光光度法测定的灵敏度就愈高.1.6理论值与实测值偏差的解释：实测值偏离了朗伯比尔定律。偏离Lambert-Beer定律的因素：1复合光对Beer定律的偏离：吸收定律要求入射光为单色光，而分光光度计单色光的纯度主要决定于色散元件及光路设计，即使高精度的仪器，也得不到纯单色光，而是波长宽度的复合光，其结果导致偏离LambertBeer定律。2杂散光的影响：杂散光(straylight)是进入检测器待测波长以外的光。主要来源于仪器色散元件表面的散射、单色器内壁尘埃等。3狭缝宽度的影响：单色器设有进、出口狭缝，狭缝愈窄，单色光愈纯，吸光度增加，但辐射能减小，对弱吸收带的测量有一定影响。定性分析时，为提高分辨能力常采用较小的狭缝，而定量分析时，在灵敏度允许的情况下，宜采用较大狭缝。当出、入射狭缝宽度相等时，狭缝宽度引起的误差最小。4非吸收作用引起的误差：1.散射效应：光吸收定律只适用于均匀的吸收体系，如待测溶液是混浊的，当光通过时，将产生散射效应。其结果使光通过吸收物质的光程不固定，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致偏离Beer定律。因此，免疫比浊法常用多点校准来做标准曲线。2.荧光效应：分子吸收辐射能后产生的激发态分子以重新发射辐射的方式回到基态而发射荧光。由于多数显色体系荧光效应很小，而且荧光发射是各向同性，只有一部分沿透射光方向进入检测器，使测量吸光度偏低。一般情况下，荧光效应对分光光度法产生的影响较小。目前，多数光度计设有两个样品室，对有荧光试样可置于离检测器较远的样品室，或在光路中插入适当的滤光片以消除荧光效应。5测定过程中产生的误差：化学反应引起的误差，人为的误差等，在此不作详细解释。1.7生化测定方法：临床化学自动分析仪所涉及的测定方法包括终点测定法、连续监测法、固定时间法等。1.8.1生化分析基本术语概述：1双波长：由主波长和副波长构成的两个波长，测定样品采用双波长可以消除对实验的影响。主波长是指测定某物质时，生成的产物颜色对光吸收的特有波长。副波长是指测定某物质时，为消除其他干扰物质在主波长造成测定干扰所设定的波长。2反应杯空白：在特定波长下，光通过以蒸馏水或空气为反应体系所测得的吸光度值。3试剂空白：在各特定波长下，光通过以蒸馏水或生理盐水为样品和相应测定项目试剂构成的反应体系时所测得的吸光度值。4样品空白：在各特定波长下，光通过以生物样品和相应测定项目（不含有引起反应的一种或多种成分的试剂）构成的反应体系所测得的吸光度值；或由生物样品和相应测定项目试剂构成的反应体系产生反应最初时间所测得的吸光度值。5终点法：这是最常用的分析法。因为该法常有标准液，因此又称比例终点法，是经过一定反应时间后，当反应达到平衡(终点)时做到的一点分析法。一般是在一定温度下，试剂与样品经过一定反应时间，被送入比色系统，然后检测吸光度的变化，由微机系统处理计算和打印显示出结果。其中又分一点终点和两点终点法。6、连续监测法：也叫速率法，此法通过测定酶所催化的反应速度，间接计算出酶的含量，称酶活性测定法。在酶促反应过程中，不是任何时期的反应速率都和酶浓度成正比。当酶促反应刚一开始，底物处于过量状态，酶与底物开始结合，生成复合物(ES)，底物浓度开始下降，此时产物尚未生成。当复合物(ES)分解，生成产物(P)，酶促反应速度急骤上升，经过很短的作用时间后，产物的生成量或底物的减少量与反应时间成线性关系，反应速度保持恒定不变，这一时期称为零级反应期。随酶促反应继续进行，底物不断消耗，酶促反应条件逐渐变化，酶促反应速度逐渐减慢，产物生成或底物减少量的变化曲线遂趋平坦，这一时期称为一级反应期。此时的反应速率常常不能准确反应酶的含量。因此其测光点一般要求取在反应达到平衡前。7、两点速率法：两点速率法也叫固定时间法，对测定及标准采用两个时间点测定。采用此方法的如肌酐（苦味酸法），目前多数自动分析仪还是用Jaffe氏反应测肌酐，即肌酐能同碱性苦味酸盐生成红橙色化合物，这个反应特异性不高，因为维生素C、丙酣酸、丙酣、葡萄糖、乙酷醋酸、果糖、氨基马尿酸、蛋白质及其他反应产物亦能与碱性苦位酸盐生成红色化合物，血清中的这些假肌酐约含25%。但真性肌酐与苦味酸的反应为快反应，假肌酐为慢反应，因此测试时测试时间一般在样品与碱性苦味酸试剂混合后25秒和1分25秒在500nm处测吸光度变化。两时间点的吸光度变化之差，则为特异反应肌酐浓度。8普通免疫比浊与胶乳增强免疫比浊法：普通免疫比浊法：是抗原与相应的抗体直接结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。胶乳增强免疫比浊法：是将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻碍光线透过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过的光减少，其减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，即与待测抗原量呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。该法比普通免疫比浊敏感度高，试剂稳定，个体免疫复合物对结果影响也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高。9参考物的量值溯源性:通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链,使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准,通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。10检测限：是指检测系统可检测出的最低分析物浓度。又称分析灵敏度。11灵敏度与线性范围：灵敏度与线性范围有着紧密联系，这也是跟生化仪的性能有关。灵敏度与线性范围的取舍就要根据其医学决定水平而定。一般仪器能测的光密度值最大在35000。假设谋项目的医学决定水平在0~100，如果1个单位浓度变化能引起仪器吸光度响应量为1000，那么它能测的浓度范围为0~35，可以看出，虽然其灵敏度很高，但在其检测范围没有达到其医学决定水平，即线性范围太窄。相反，如果1个单位浓度变化能引起仪器吸光度响应量为100，那么它能测的浓度范围为0~350，这个线性范围是可以的。因此，灵敏度与线性的评价，要根据其医学决定水平而定。1.9常用校准方法：终点法或两点速率法，必须通过使用标准液，建立一条标准曲线；速率法，采用标准液校正可消除系统误差，也可直接输入Factor值。校准类型：空白定标：以水做标准液，消除试剂本身对测试的干扰；（酶类）两点定标：以水作为零点，标准液作为另一点，建立标准曲线；（Y=AX+B）多点定标：两个以上的标准液建立一条标准曲线；（LOGIT-LOG）1.10参考区间与医学决定水平：临床实验室检验结果对被检验者低正常还是异常，有何临床意义，如何用检验结果协助临床医生诊断和治疗，这就涉及到参考区间和医学决定水平了。参考区间大多是采用正态分布的原理制定，以95%的分布区间（x±2s）即为参考区间的上、下限，少数用百分位数来制定参考区间。不论采用什么方法，总有少数正常人的测定值落在异常范围内。因此，假性结果是避免不了的。当结果接近上限或下限时，不要轻易下正常或有病的结论，要根据被测者的其他表征综合判断或过一段时间复查后，再做分析。医学决定水平是由Barnett于1968年首先提出的。是指临床上必须采取措施时的检测水平。决定性水平是一个阀值，高于该值或低于该值，应决定对患者采取适当的治疗措施。医学决定水平可在疾病诊断中起着排除或确认的作用，对某些疾病进行分级或分类，或愈后做出估计，来提醒医生在临床上做出相应的处理方式。医学决定水平与参考区间的区别在于它不仅对健康人的数值进行研究，以决定健康人的范围，同时还对有关疾病的不同病情的数据进行研究，以定出不同的决定性限值，以引导医生采取不同的临床措施。它的应用可以克服只使用参考范围的缺点，使一个检验结果对病人能起到提供诊断，处理依据的作用。1.11酶法检测基本知识：酶是由活细胞产生并能在体内起催化作用的，一类特殊蛋白质。体内几乎所有的代谢反应都是在不同的酶催化下进行的。酶的催化效率高，对底物有严格的选择性，酶非常不稳定，酶浓度的变化是许多疾病的敏感指针，这是建立和发展诊断酶学的依据。用酶作试剂(工具酶)测定非酶物质具有效率高、特异及易于实现自动分析的特点，是目前临床生化检验的主流方法。1.11.1酶促反应速度的因素：包括:酶的浓度、底物的浓度、激活剂与抑制剂、pH和温度等。在研究某一因素对酶促反应速度的影响时，反应系统中其他因素不变。酶促反应中所指速度是初速度，因为这时的反应速度与酶浓度成正比，可以避免产物及其他因素对反应速度的影响。在建立定量测定酶活性的方法时，需要研究酶促反应的速度及影响此速度的因素，通常称之为反应动力学。1.11.2酶活力测定酶的含量很低，除免疫学方法外，不能直接测定其含量，只能测其催化反应过程中一定时间内物质变化的量，即酶促反应速率，或称酶的活力。要保证只有待测酶的量影响反应速率，其他各种影响反应速率的因素都在严格控制之下，并保持各测定间的一致性。（一）酶促反应的过程通过测定底物浓度的下降，或测定产物浓度的上升，可以追踪酶反应过程中底物转变为产物的过程。通常多测定产物的形成，因为测定产物从零或者从低浓度的增加，比测定高浓度底物的下降更可靠。典型的酶反应过程曲线分为几个时期。紧随着加人血清或底物启动反应后，在出现明显的变化前为延迟期;此期从几秒到几分钟。随后是底物和产物变化与时间成直线的时期，形成产物的速率恒定，此时期的速率为反应初速度。此期底物也下降，但实际上反应速度与底物浓无关，对底物浓度而言，酶促反应实际上是零级反应。反应曲线的直线期时间长短相差悬殊。紧跟着是反应速率持续下降，进入速度依赖于底物浓度的一级反应期。在这一期中，底物浓度下降，逆反应增加，抑制性产物蓄积，乃至酶本身进行性的灭活等因素也起作用。最后，当底物起尽或达到平衡时，反应停止。在零级反应期中，测定一定时间内形成产物的量，是以此期中速率维持恒定为条件。否则表观的反应速率将不正比于酶浓度。也就是选择的监测点必须在反应速率恒定区（零级反应期）。在正常测定中，为了能缩短延迟期和延长线性期，不仅要适量的底物浓度，还要在试剂中加入某些激活剂和其他的辅助因子。以改善反应进程曲线。(二)固定时间法和连续监测法在我国临床实验室中，目前测定酶活性的方法，已从手工操作的固定时间法及两点测定法过渡到连续监测法。固定时间法在反应过程中测定一点的吸光度;两点测定法是在反应开始及反应经一定时间后，分别测两点的吸光度，根据两点间吸光度的差值，推算酶的活力。固定时间法和两点测定法都是在酶和底物孵育一段时间后测定总的变化。两点测定法也应属于酶动力学测定方法，但动力学测定法这一术语，习惯上仅指多点测定的动力学方法，即所谓速率法或连续监测法，不论用手工法或自动法。固定时间法和两点测定法可能会有几种误差:酶活力非常高的样品，由于底物消耗速度快，反应很快呈现迟缓或停止；有一些反应类型延迟期长