乙型肝炎病毒耐药的一些基本概念

慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗的地位和作用已经得到了确立，未来几年这一领域的发展方向就是新型NA的研发。随着对CHB抗病毒治疗临床研究的不断深入，在核苷（酸）类似物（NA）抗乙型肝炎病毒（HBV）治疗临床研究中发现HBV的耐药是一个普遍和突出的问题，只有充分重视HBV耐药的研究，才能更有效地贯彻长期抗病毒治疗的方针。一、乙型肝炎病毒耐药的一些基本概念HBV的基因耐药（geneticresistance）是指CHB患者血中的HBV基因序列出现了耐药相关的基因突变。如果检测到了HBVDNA耐药相关的基因序列，那么这种基因耐药肯定是存在的；如果检测结果阴性，却不能完全排除存在耐药基因变异病毒的可能性。在CHB患者血中检测到了耐药相关的基因突变，把变异的HBVDNA实现全基因克隆化，构建真核表达载体，体外转染肝癌细胞系，进行NA的EC50/IC50的测定，如与野生株相比克隆的病毒株对药物的敏感性降低4倍以上，可确定为表型耐药（phenotypicresistance）。表型耐药是体外试验结果的一种描述。HBVDNA的反弹（rebound）或者称为突破（breakthrough）是指CHB患者在抗病毒治疗过程中，HBVDNA载量较最低水平上升1log10。ALT水平从正常值上限显著上升、或者在原来基础上出现ALT水平的显著升高，称为ALT波动（flare），这反映了由于病毒复制水平增加，导致肝脏炎症活动，表现为血清ALT水平升高。临床恶化（deterioration或exacerbation）是CHB患者因为病毒复制和肝脏炎症加剧，导致临床症状和体征的加剧或恶化。针对一种药物的耐药基因突变，同时对于另外一种无关的药物也出现耐药现象，称为交叉耐药（crossresistance）。交叉耐药产生是有其结构基础的，是交叉耐药相关药物耐药基因位点的接近或重叠造成的。二、乙型肝炎病毒耐药的一些基本理论为什么在抗病毒治疗过程中会出现耐药？主要原因是HBV自身复制能力很强，每24小时可以复制1012~13个拷贝，在复制的逆转录过程中，逆转录酶缺乏严格校正机制，自发突变率达10-5。HBV突变是绝对的，遗传是相对的。HBV感染的几十年中，积累了大量的基因序列突变的HBV病毒株，而有些病毒的基因变异恰好位于HBVDNA聚合酶的区域，就会产生耐药。以前认为，突变病毒株复制能力比野生型病毒复制能力有下降，但是目前认为HBVDNA突变对于病毒复制能力的影响是多种多样的：或降低其复制能力，或提高其复制能力，或没有影响。在没有NA抗病毒治疗的时候，各种病毒株在病毒群中所占的比例，主要由各种病毒复制能力等因素所决定。NA抗病毒治疗时，各种病毒因对药物敏感性不同，从而在病毒群中的相对比例就会开始出现差别。对于NA抗病毒治疗敏感的病毒株，因为受到选择性的压力其在病毒群中的绝对数和相对比例会逐渐减少，而耐药的病毒株绝对数影响不大，但相对比率逐渐上升。因此，经过抗病毒药物的选择，最终耐药病毒株从劣势种群逐渐演变成优势种群。在很多情况下，特别是感染了HBV很长时间的CHB患者，在血清中存在着各种各样的病毒株，只是比例不同。由于目前扩增HBVDNA序列的技术，都是依赖于PCR扩增技术，而PCR扩增技术是基于引物与模板之间的竞争性结合，因此，PCR阳性的结果，依赖于被扩增的模板在病毒群中所占的相对比例。简单说就是被扩增的特定病毒株必须在病毒群中的相对比例，必须达到最低的阈值。因此，基于PCR原理的HBVDNA扩增结果，如果获得了变异的病毒株，可以肯定变异病毒株的存在，但是，检测结果的阴性，则并不能完全排除变异病毒的存在，或许只存在少量的变异病毒，而没有达到其阈值，PCR扩增出现了假阴性而已。因此，对于HBVDNA检测结果必须有一个更为客观的认识。耐药研究提出了基因屏障（geneticbarrier）和药代动力学屏障（pharmacodynamicbarrier）的学说。不同的药物耐药的产生，决定于不同的基因序列的变异。如果只要出现一种或者一个位点的基因变异就产生耐药，就比同时出现多个为突变才产生耐药更容易一些，这就是所谓的基因屏障。因为NA抗病毒治疗对病毒复制抑制程度不同，而耐药病毒的产生，主要是因为药物抑制病毒复制的活性不彻底，如果一种药物对于无论野生型还是耐药病毒的复制能力都有很强的抑制作用，病毒的复制水平维持在很低的水平，产生耐药病毒的可能性就很小。这就是所谓的药代动力学屏障。药代动力学屏障的另外一层含义就是，早期抑制病毒的能力越强，产生耐药病毒的可能性就越小。这在所有的NA的临床研究中都是如此。将病毒的复制水平越早降低到检测不到的水平，耐药产生的可能性就越小。因此，临床上所应用的NA，抑制病毒的作用越强、越快，产生耐药的机会就越小。当然，这些因素不是产生耐药的全部决定因素，CHB患者临床耐药的产生是由病毒、机体免疫力、药物作用的特点等综合的因素来决定的。HBV准种特点的研究对于理解CHB患者临床耐药的形成过程和临床特点具有很大的帮助和意义。从准种特点来看，任何CHB患者血液中的HBV都是以不同种群存在的，种群的性质和特点，主要取决于病毒群不同组分的复制能力和机体的免疫力之间相互作用最终达到的一种平衡的结果。但是，开始应用NA进行抗病毒治疗时，这种平衡就被打破了，在药物选择的作用下，形成了新的平衡，各种病毒种群所占的相对比率也进行了新的调整。优势种群和不同的劣势种群存在着一种转换，称之为种群的的漂变（shift）。应用HBV准种的理论理解NA抗病毒治疗中的一些变化规律，非常有价值。三、乙型肝炎病毒耐药的处理原则自从1999年拉米夫定在中国上市，超过120万CHB患者曾经应用拉米夫定进行抗病毒治疗，目前拉米夫定耐药即YMDD结构域突变的耐药的临床处理是摆在我们面前的一项重要任务。拉米夫定耐药产生的比例随着治疗时间的延长而显著升高，1~5年的耐药率分别为20%、38%、49%、66%、69%。早期的研究表明，如果出现拉米夫定耐药，拉米夫定与阿德福韦酯重叠用药1~3个月后停用拉米夫定，与拉米夫定联合阿德福韦酯的临床疗效没有差别，但18个月以后，两药联合治疗的方案就显示出优势：更好的疗效，更低的针对阿德福韦酯的耐药。因此，更多的临床资料表明拉米夫定联合阿德福韦酯的方案对于长期抗病毒治疗来说可能更为合理。恩替卡韦抗病毒治疗，应该用1.0mg/日的治疗剂量。当然，针对拉米夫定耐药，也可以改用干扰素特别是聚乙二醇化干扰素治疗。将来可以选择其他的新型核苷类似物如泰诺福韦等。阿德福韦酯的耐药，主要是N236T或A181V的变异，因为与拉米夫定的YMDD位点没有重叠，因此，出现阿德福韦酯的耐药，应用拉米夫定是有效的。但拉米夫定对N236T突变株有效，对A181V突变株的敏感性下降。阿德福韦酯治疗5年的基因耐药、表型耐药和临床耐药的比率分别为29%、16%、11%，显著低于拉米夫定的耐药率。N236T耐药可选恩替卡韦或替比夫定治疗，而A181V突变对拉米夫定、恩替卡韦的敏感性有所下降，对泰诺福韦具有很好的敏感性。恩替卡韦临床应用时间尚短。初步临床结果表明，未经核苷类似物治疗的患者在恩替卡韦治疗96周后，较少有耐药的发生，拉米夫定耐药患者在恩替卡韦治疗48周后，大约7%的患者出现恩替卡韦的耐药。对于恩替卡韦耐药患者，加用或换用阿德福韦酯或泰诺福韦。针对多种NA的都耐药的所谓的多重耐药，随着NA的长期应用势必要出现。但是，针对多重耐药的处理原则还有待于进一步的临床研究。四、乙型肝炎病毒耐药研究存在的问题目前对于NA耐药的临床研究可谓刚刚开始，对于许多现象和规律的认识还很初步，需要进行大量的临床研究和实验研究。我们对HBV药物敏感性和耐药性的特点和产生规律的研究和认识也刚刚开始。也正因为如此，目前我们在CHB患者临床抗病毒治疗的药物选择方面还存在着很大的盲目性。我们还没有像指导临床抗生素应用的体外药敏实验系统，抗病毒药物的选择缺乏很好的循证医学的证据。对于病毒种群的认识、对于病毒耐药的认识，必将进一步推动这方面的进展。将来的发展方向，就是最大程度地了解病毒种群的性质，病毒种群对于不同药物敏感性的差别，病毒种群对于不同药物耐药的差别，并最终产生检测不同病毒种群的高通量技术，来指导抗病毒药物的选择。有了这样的客观的临床依据，必将促进抗病毒药物的正确选择，也必将会大幅度提高抗病毒治疗的疗效。十年的核苷（酸）类似物抗HBV治疗的临床实践已证明口服核苷（酸）类似物的四种特性：“有效性”即在应用时可持续地抑制HBV复制；“易行性”即这类药物均口服，每天1片，简单方便；以及“安全性”，即不良反应少；但治疗过程中所出现的“耐药性”已成为影响其长期抗病毒治疗的最大“临床问题”之一。HBV临床耐药是当前核苷（酸）类抗HBV药物长期治疗所面对的主要问题。一旦耐药发生，可能伴随而来的是抗病毒药物的效力丧失，临床出现HBV载量上升，ALT上升，从而影响和改变患者的临床结局。具体表现为肝脏疾病进展，如肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至肝衰竭、死亡等；对于肝移植患者，耐药将导致肝移植物发生排斥、肝移植失败。另外，耐药还可能给公共卫生带来极大的危害，核苷类似物耐药突变从理论上讲，可能导致HBsAg“a”决定簇发生变异，使现行乙型肝炎疫苗失去保护能力；同时也存在拉米夫定耐药乙型肝炎病毒株传播的可能，从而改变慢性乙型肝炎的自然史，给慢性乙型肝炎的防治工作造成困难。临床耐药管理的现实具体问题是，当前针对耐药所采取的主要“救援”治疗方法，有可能降低后续治疗药物的疗效，增加其耐药发生的风险，甚至发生所谓“多药耐药性肝炎”，使进一步治疗药物选择受限。因此，有效地管理核苷（酸）类似物抗HBV治疗临床耐药，需要规范与耐药相关的概念，了解不同结构类型药物的耐药途径，正确、客观分析各个药物采用不同的监测人群、检测手段和分析方法得到的耐药数据，通过管理时间前移（提前）的观念（即从现在的“救援”治疗，前移至早期预测乃至起点预防），加强监测，有效干预，才能在临床实践中避免或延迟耐药的发生。二、耐药及耐药变异的相关概念由于对HBV的研究及抗病毒治疗的飞速发展，目前国际上的耐药术语和相关概念还没有形成统一的标准。这一现象与不同临床试验设计所产生结果是否具有可比性，以及HBV耐药的复杂性都有一定关系。因此，规范耐药相关名词和标准对慢性乙型肝炎的疗效评价和耐药管理有着重要意义。耐药是由于HBV对药物发生适应性突变，导致药物抑制病毒作用的敏感度下降，临床的相应表现为被抑制的病毒重新复制（HBV重新升高），再次出现肝损害表现（ALT重新升高）。相关的术语包括基因型耐药、表型耐药、病毒学突破、生物化学突破、交叉耐药、多药耐药。基因型耐药（genotypicresistance）是指出现了导致药物靶位氨基酸变异的单核苷酸变异，这些变异在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关；表型耐药（phenotypicresistance）是指将检测到的核苷酸变异及其编码的氨基酸替代变异病毒株，通过体外复制系统证实降低了其对抗病毒药物的敏感性；病毒学突破（virologicbreakthrough）指在治疗过程中，虽然患者对药物治疗有良好的依从性，相隔1个月的连续2次检查，血清HBVDNA载量比获得应答后的最低值的上升值均＞1log10拷贝/ml，常提示耐药的产生；生物化学突破（biochemicalbreakthrough）是指治疗达到ALT复常后，在继续治疗的过程中，ALT水平升高并超过正常值上限；交叉耐药（crossresistance）指在抗HBV的治疗中，当使用一种药物造成这些靶位氨基酸变异后，这一耐药病毒株对其他具有相同作用靶位的药物也具有耐药性；多药耐药（multidrugresistance）指序贯或同时使用不同作用靶位的药物进行治疗，HBV可在不同药物的靶位发生耐药变异，产生对多种药物耐药的变异病毒株。临床发现，耐药依赖于患者对抗病毒药物治疗的应答，目前抗病毒药物治疗的病毒学应答主要分为：完全应答（completeresponse），指HB