人FUT3基因真核表达载体的构建与表达

ISSN1009-3079CN14-1260/R世界华人消化杂志2009年11月8日;17(31):3210-3213基础研究BASICRESEARCH人FUT3基因真核表达载体的构建与表达岳丽玲,樊丽,刘吉成岳丽玲,樊丽,刘吉成,齐齐哈尔医学院医药科学研究所黑龙江省齐齐哈尔市161006岳丽玲,黑龙江中医药大学黑龙江省哈尔滨市150040岳丽玲,在读博士,副教授,主要从事多糖抗肿瘤的研究.国家自然科学基金资助项目,No.30772751黑龙江省青年科学资金资助项目,No.QC08C28作者贡献分布:本课题由岳丽玲与樊丽设计;研究过程由岳丽玲与樊丽操作,刘吉成指导完成;本论文写作由岳丽玲完成.通讯作者:刘吉成,教授,博士生导师,161006,黑龙江省齐齐哈尔市,齐齐哈尔医学院医药科学研究所[e-mail]电话:[phone]收稿日期:2009-09-02修回日期:2009-11-02接受日期:2009-11-02在线出版日期:2009-11-08ConstructionofhumanFUT3eukaryoticexpressionvectoranditsexpressioninhumanbreastadenocarcinomacellsLi-LingYue,LiFan,Ji-ChengLiuLi-LingYue,LiFan,Ji-ChengLiu,MedicineandDrugResearchInstitute,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,HeilongjiangProvince,ChinaLi-LingYue,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,HeilongjiangProvince,ChinaSupportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina,No.30772751;andtheYouthScienceFoundationofHeilongjiangProvince,No.QC08C28Correspondenceto:ProfessorJi-ChengLiu,MedicineandDrugResearchInstitute,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,HeilongjiangProvince,[e-mail]:2009-09-02Revised:2009-11-02Accepted:2009-11-02Publishedonline:2009-11-08AbstractAIM:ToconstructthehumanFUT3(α1,3-fucosyltransferase)eukaryoticexpressionvectorandanalyzeitsexpressioninhumanbreastadenocarcinomaMDA-MB-231cells.METHODS:Thefull-lengthFUT3cDNAwasobtainedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)andclonedintopMD18-Tsimplevectorforsequenceanalysis.ThentheFUT3genewassubclonedintopEGFP-C1plasmid.TheresultingrecombinantvectorpEGFP-C1-FUT3wasidentifiedbydigestionwithrestrictionendonucleasesandtransfectedintoMDA-MB-231cells.AstablytransfectedcelllinewasestablishedusingG418selection.TheexpressionofFUT3wasobservedunderafluorescencemicroscopeandexaminedbysemi-quantitativeRT-PCR.RESULTS:Thefull-lengthhumanFUT3cDNAwassuccessfullyobtained,andtherecombinantplasmidpEGFP-C1-FUT3wassuccessfullyconstructed.AftertransfectionintoMDA-MB-231cells,greenfluorescence(greenfluorescentprotein)wasobserved.Semi-quantitativeRT-PCRanalysisshowedthatFUT3washighlyexpressedinMDA-MB-231cells.CONCLUSION:TheFUT3eukaryoticexpressionvectorpEGFP-C1-FUT3thatcanexpressFUT3inMDA-MB-231cellsisconstructedsuccessfullyandcanbeusedtostudythebiologicalfunctionsoftheFUT3gene.KeyWords:α1,3-fucosyltransferaseIII;Enhancedgreenfluorescentprotein;GenecloningYueLL,FanL,LiuJC.ConstructionofhumanFUT3eukaryoticexpressionvectoranditsexpressioninhumanbreastadenocarcinomacells.ShijieHuarenXiaohuaZazhi2009;17(31):3210-3213摘要目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达载体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表达.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达载体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.关键词:α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅲ;增强型绿色荧光蛋白;基因克隆世界华人消化杂志2009;17(31):岳丽玲,樊丽,刘吉成.人FUT3基因真核表达载体的构建与表达.3210-3213引言肿瘤复发转移是癌症患者死亡的主要原因,异常糖基化是恶性肿瘤转移的重要机制之一.Lewis寡糖抗原是细胞表面糖复合物(糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖)中的糖链成分,已经发现其在多种肿瘤中的合成异常增加,与肿瘤增殖、浸润、转移、临床分期及预后密切相关[1].岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT)是参与合成Lewis寡糖抗原的关键酶,催化GDP-Fuc的Fuc转移至糖链中N-乙酰氨基乳糖残基的N-乙酰氨基葡萄糖上,并以α1,2、α1,3/4和α1,6岩藻糖苷键相连接[2].αFUT共有9个亚型,其中只有αFUT3可以形成α1,3以及α1,4两类键,故又称为α1,3/1,4FUT3,既可合成LeX、LeY及sLeX,又可合成LeA、LeB及sLeA[3].本研究成功地构建人FUT3基因真核表达载体pEGFP-C1-FUT3,并体外转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,为进一步研究FUT3及其产物Lewis抗原的表达调控提供实验基础.1材料和方法1.1材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自上海中科院细胞库;大肠杆菌DH5α感受态细胞由本室保存;脂质体(lipofectamineTM2000)及TRIzol为Invitrogen公司产品;pEGFP-C1质粒购自BiosciencesClontech公司;胎牛血清、Leibovitz'sL-15培养基购自Gibco公司;血液总RNA提取试剂盒、质粒小量及中量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Omega公司;限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA连接酶、pMD18-TSimple、RT-PCR试剂盒为TaKaRa公司产品,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.其他试剂均为国产分析纯.1.2方法1.2.1目的基因FUT3的RT-PCR扩增:参照GenBankFUT3基因ORF序列通过Primer5.0软件设计特异性引物:上游5'-ccgctcgagTTCGCAACCCATACAGTGAA-3',下游5'-ccggaattcCAGGCAGATGAGGTTCCC-3',分别在5'端加上XhoⅠ和EcoRⅠ的酶切位点.采用Omega血液总RNA提取试剂盒提取健康男性外周血总RNA.以总RNA为模板,使用TaKaRacDNAKit进行逆转录反应,获得cDNA.PCR扩增FUT3基因,反应体系按说明书,反应条件为:95℃预变性5min,95℃变性50s,62.8℃退火lmin,72℃延伸1.5min,35个循环;最后72℃延伸10min,扩增片段长度为1172bp.PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定.1.2.2T载体克隆和测序:DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物,将目的片段与pMD18-T载体16℃过夜连接.取连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌,蓝白斑筛选挑取阳性克隆送交Invitrogen公司测序鉴定.1.2.3pEGFP-C1-FUT3真核表达载体的构建:用XhoⅠ、EcoRⅠ分别双酶切重组pMD18-T-FUT3质粒及pEGFP-C1空载体,凝胶电泳回收并纯化目的基因片段,用T4DNA连接酶连接,过夜.次日,连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌,Omega小提质粒试剂盒抽提质粒DNA,内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定.1.2.4真核表达载体pEGFP-C1-FUT3转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231:转染前24h将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231用胰酶消化,按4×105个细胞/孔的浓度接种于6孔板内,37℃培养至细胞密度为80%-90%时换无血清无双抗Leibovitz'sL-15培养基,用脂质体lipofectamineTM2000分别介导空质粒及重组质粒转染MDA-MB-231细胞,按试剂说明书进行操作.转染24h后,换用含有G418(800mg/L)的L-15培养液进行筛选,2wk后G418改为400mg/L维持剂量筛选.分离出抗G418的阳性克隆,然后再扩大培养,得到稳定传代的细胞克隆,荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达情况.1.2.5RT-PCR鉴定FUT3基因在MDA-MB-231细胞中的稳定表达:收集稳定转染FUT3基因的乳腺癌MDA-MB-231细胞,用TRIzol提取细胞总RNA,进行逆转录.以β-actin为内参照,半定量PCR鉴定FUT3基因.FUT3引物序列为:上游5'-GAAGCTGTGGAGGAACGC-3',下游5'-TGAACCAAGCCGCTATGC3-3',扩增片段为308bp;β-actin引物序列为:上游5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3',下游5'-GAAAGGGTGTAACGCA