二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用

二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用█山东大学齐鲁医院临床药理研究所李平利张蕊郭瑞臣5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前体药物卡培他滨临床常用于乳腺癌、结直肠癌及头颈癌等多种肿瘤的治疗。5-FU进入机体后，80%以上经肝脏二氢嘧啶脱氢酶（DPD）代谢并转化为氟代β-丙氨酸（FBAL），FBAL的代谢产物为氟乙酸（Fluoroacetate）和氟代柠檬酸（F-citrate），是引起5-FU心脏及神经毒性的主要活性物质。部分未经DPD代谢的5-FU在体内转化为具有生物活性的FUTP和FdUTP，通过干扰肿瘤细胞RNA或DNA的生物合成发挥抗肿瘤作用，或转化为FdUMP，与胸苷酸合成酶（TS）、5，10-亚甲基四氢叶酸（CH2THF）形成稳定的三联复合物，抑制TS正常功能，干扰DNA合成，发挥DNA介导的细胞毒性作用（如图所示）。DPD基因（DPYD）存在多态性，不同个体间DPD活性差异较大，甚至部分或完全缺失。DPD部分或完全缺失个体，5-FU常规剂量可导致清除率降低，发生5-FU相关毒性，如粘膜炎、粒细胞减少症、神经性病变，甚至死亡。而DPD高表达个体，则造成5-FU耐受，常规剂量难以达到理想治疗效果。由于DPYD基因存在多个突变位点，或可能存在未知位点，或某些位点功能活性的研究尚不完全，导致已知DPYD基因突变与DPD表型缺乏一致性。因此，DPD活性测定对于5-FU个体化治疗更具重要意义。其他参与5-FU体内生物转化的尿苷磷酸化酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、胸苷磷酸化酶等的基因型及活性不同个体间也不完全相同，使产生活性代谢产物FUTP、FdUTP、FdUMP的量存在差异。而FUTP、FdUTP及FdUMP是杀伤肿瘤细胞的直接作用形式，故测定其细胞内浓度可更直接地揭示或预测5-FU的疗效或毒副作用。因此，直接或间接测定DPD活性及5-FU活性代谢产物水平有助于制订、调整、修饰5-FU的给药方案，提高疗效，降低毒副作用，并进一步评价常规5-FU浓度测定的优势和局限性，明确5-FU发挥药效或产生毒副作用的机制。1.DPD活性测定DPD活性测定包括表型测定（Phenotype）、基因型测定（Genotype）、蛋白表达及mRNA水平测定。1.1DPD表型测定表型指在环境影响下基因型所发生的机体的物理表现和可见性状，不同表型药物代谢酶的催化代谢活性大小,可通过测定其底物的代谢率断定。底物可以是外源性探针药物，如异烟肼、氨苯砜、咖啡因等可用于测定N-乙酰基转移酶表型测定，非治疗目的，一次性服用；也可以是治疗药物，如5-氟尿嘧啶，以原形与代谢物比值表示相关酶活性的强弱。DPD分布于人体多个组织、器官，但主要存在于肝脏，参与80%以上5-FU的肝脏代谢。测定血浆或尿液二氢尿嘧啶（UH2）、尿嘧啶（U）、二氢胸腺嘧啶（THY2）、胸腺嘧啶（THY）、二氢氟尿嘧啶（5-FUH2）、氟尿嘧啶（5-FU）浓度，计算UH2/U、THY2/THY、5-FUH2/5-FU值可间接反映DPD活性。BenFredj等采用高效液相色谱-紫外方法测定9例接受5-FU/亚叶酸钙化疗的晚期结直肠癌患者血浆UH2与U峰面积，计算所得UH2/U值范围为0.07～3.12。该比值与相应5-FU血浆半衰期呈负指数相关，与患者5-FU毒性相关。Serdar等采用LC-MS/MS测定45例接受5-FU治疗患者PBMCs中5-FUH2和5-FU浓度，计算得5-FUH2/5-FU值为21.9±3.72，2例DPD缺失患者分别为1.26和1.61，说明DPD活性缺失可使5-FU的清除率严重降低。VanKuilenburgAB等以放射性[4-14C]THY为底物，采用反相高效液相色谱方法检测THY及其降解产物THY2浓度，以每毫克蛋白每小时代谢生成的THY2nmol数表示DPD活性。结果显示，2例5-FU治疗出现严重毒性反应的癌症患者PBMCsDPD活性分别为3.2nmol·mg-1·h-1和4.2nmol·mg-1·h-1，低于健康志愿者平均DPD活性水平。其中1例患者治疗后康复期DPD活性恢复到正常水平（8.6nmol·mg-1·h-1）。进一步研究显示，44例接受5-FU/亚叶酸钙化疗患者PBMCs中DPD活性在4.2～16.0nmol·mg-1·h-1范围内呈高斯分布，较低DPD活性与中性粒细胞减少症显著相关，但与胃肠道反应、流感样症状、手足综合征等毒副反应无相关性。Büchel等采用LC-MS/MS方法测定10例结直肠癌患者接受5-FU治疗前内源性血浆U、UH2及接受5-FU治疗2h后外源性5-FU、5-FUH2浓度。结果显示，U和UH2浓度范围分别为（0.07～2.6）和（0.81～1.77）μM，UH2/U值为3.7～15.4；5-FU和5-FUH2浓度范围为（1.4～6.7）和（9.1～25.8）μM。由于DPD可能存在饱和状态，接受5-FU治疗后，即体内有5-FU存在时，U和UH2浓度高于接受5-FU治疗前，即体内不存在5-FU时。Sistonen等认为，多数个体，接受5-FU治疗前的UH2/U值为DPD非饱和状态时的活性，不能准确反映DPD活性变化，而5-FU治疗期间所得UH2/U值更准确。因此，接受5-FU治疗前给予一定量DPD底物（如U），所得UH2/U值可更准确评估DPD活性，并准确预测5-FU相关性毒性。另外，由于5-FU可被DPD代谢为FBAL，FBAL水平也可一定程度上反映DPD活性。有报道采用RP-HPLC法测定体外细胞内经DPD分解的5-FU代谢物FBAL浓度，或采用LC-MS/MS法测定职业暴露于5-FU人员尿液FBAL浓度，可用于监测、评价医护人员暴露于5-FU的风险，也可用于DPD活性测定。采用探针药物间接测定DPD活性，包括其他药物代谢酶，快速、简便，易于推广，但探针药物须代谢机制清楚，代谢途径单一；排除其他疾病、年龄因素影响；原形和代谢物浓度测定方法应灵敏专一。1.2DPYD基因型测定已知DPYD基因存在30多种单核苷酸多态性及缺失突变，包括DPYD*2A、DPYD*13等，可造成DPD活性降低或缺乏。不同的基因位点突变对DPD活性影响不同，因此，明确DPYD基因型与活性之间的相关性可用于指导5-FU剂量方案调整。DPYD*2A突变导致第14位外显子缺失，造成DPD活性降低甚至丧失。一项Meta分析结果表明，DPYD*2A突变与5-FU相关毒性反应（≥3级）密切相关（OR5.42，P0.001），须将5-FU或卡培他滨初始给药剂量降至标准剂量的50%，以降低DPYD*2A突变携带者发生严重毒性反应的风险。Henricks等认为，DPYD*2A纯合突变个体，不建议给予5-FU类药物。杂合突变个体DPD活性降低50%，c.2846AT纯合突变个体降低50%，杂合突变个体降低25%，可采用荧光原位杂交、基因测序等技术分析DPYD基因多态性，根据患者基因型预测DPD活性及DPD代谢5-FU的能力，高效、简便，可用于5-FU的个体化治疗。但由于体内处置过程的复杂性和未知基因突变位点存在的可能性，以及已发现突变位点与酶活相关性有待证实，通过基因型预测酶活性尚有一定局限性。1.3DPD蛋白及mRNA水平测定DPDmRNA水平与DPD活性密切相关，肿瘤组织或细胞DPD活性可预测5-FU的治疗效应和毒性效应。因此，也可采用免疫组化或逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定肿瘤组织DPD蛋白表达，预测DPD活性。Kim等测定184名胃切除术并替吉奥（S-1）辅助化疗的胃癌患者肿瘤组织DPD蛋白表达及mRNA水平，单变量或多变量分析表明，肿瘤组织DPD蛋白表达量或mRNA水平较低患者，5年无病生存期（DFS）差，更易发生非血液学毒性（≥3级）反应。但肿瘤组织DPDmRNA高表达患者，对以5-FU为基础的化疗方案则产生较差的治疗效果。提示，DPD不仅影响5-FU及含5-FU药物治疗方案的治疗效应和毒性作用，还影响决定疗效的活性产物生成。2.5-FU活性代谢产物测定由于细胞内活性代谢物含量较低，细胞转运蛋白外排作用的程度难以确定，代谢物与内源性核苷酸结构高度类似存在干扰，较难准确测定。但FUTP、FdUTP、FdUMP确为5-FU细胞内发挥抗肿瘤作用的活性物质，细胞内水平直接反映到达作用部位的量，对于指导5-FU剂量方案调整，阐述耐受机制，有不可替代的作用。因此，应建立准确、可行、实用的体内FUTP、FdUTP、FdUMP水平测定方法。Carli等采用固相提取法，对极性化合物有较长保留时间的AtlantisC18色谱柱，流动相为甲酸铵（5mM，pH4）/甲醇/水（5/5/90，v/v），等离子梯度洗脱，三重四级杆质谱检测器定量测定MCF-7细胞内5-FdUMP（ng/μg蛋白）。结果显示，5-FU孵育后30min内，细胞内5-FdUMP的量呈线性增加。操作简便，可用于生物样本5-FdUMP检测。Derissen等建立了UPLC-MS/MS方法测定接受5-FU治疗患者PBMCs中FUTP、FdUTP、FdUMP含量。采集患者16ml外周血，提取白细胞，甲醇裂解后取上清液进样。3例口服卡培他滨及5例接受FOLFOX6化疗方案治疗的癌症患者PBMCs中FUTP、FdUTP、FdUMP测定结果显示，卡培他滨给药后0～8h内，测得FUTP最低浓度为1.84nM，但未测出FdUTP和FdUMP。同样，静脉注射5-FU患者，测得FUTP最低浓度为178nM，FdUMP最低浓度为3.39nM，但未测出FdUTP。提示该方法特异、灵敏，但需进一步优化，或扩大样本，提高研究方法的适用性，以实现对生物样本FUTP、FdUMP和FdUTP的定量检测以及临床实用价值的评价。3.展望DPD酶在5-FU化疗过程中发挥着重要的作用，掌握其生理病理特点、作用规律和影响因素有助于提高5-FU的疗效，降低其毒副作用。虽然DPYD基因多态性检测已被推荐用于预测5-FU类化疗药物的毒性及敏感性，5-FU浓度测定也被常规用于治疗药物监测，但作为补充，DPD酶活性测定可更全面反映由未知基因突变或非基因因素造成的DPD活性改变，并作为制定、调整、修饰5-FU治疗方案的依据，提高5-FU治疗的有效性和安全性。此外，尽管DPD活性研究已较为深入，但由于研究者的角度不同，如样本来源，体内体外研究，采用的方法不同，如色谱法、光谱法、免疫法等，或样本量的局限性，导致DPD活性缺乏统一的界值，即低于界值患者更大可能出现高风险毒性反应，从而需要规范设计、采用先进技术、进行更大样本量的研究，以确定DPD活性界值。5-FU活性代谢产物FUTP、FdUTP、FdUMP可直接反映其发挥疗效、产生毒副作用及耐受的机制，有助于进一步揭示5-FU代谢动力学特征，有助于5-FU的个体化治疗，有助于验证、评价5-FU常规治疗监测的可靠性及可行性，因此，排除内源性核苷酸的干扰，建立灵敏、可靠、实用、可行的细胞内ng甚至pg水平FUTP、FdUTP、FdUMP活性代谢物定量测定方法，可最大限度地指导5-FU的临床合理使用。