人类诱导性多能干细胞技术指导手册

人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术指导手册目录：1.前言.............................................................................................................................................12.人类胚胎成纤维细胞培养..........................................................................................................23.重编程载体构建..........................................................................................................................34.病毒包装.....................................................................................................................................45.人类iPS细胞的诱导..................................................................................................................66.iPS细胞鉴定..............................................................................................................................86.1碱性磷酸酶活性检测........................................................................................................86.2干细胞表面marker的免疫染色检测..............................................................................96.3干性因子的去甲基化程度分析......................................................................................106.4干细胞内源基因的表达分析..........................................................................................136.5端粒酶活性检测...............................................................................................................146.6核型检测...........................................................................................................................156.7拟胚体形成.......................................................................................................................156.8畸胎瘤形成实验...............................................................................................................157．干细胞技术培训及服务一览表...............................................................................................158．附录..........................................................................................................................................161.前言iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminilietal2008）。2006年Yamanaka和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc,和Klf4，Yamanaka因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashietal;Yuetal,2007）。由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，iPS细胞的研究日新月异。.近几年来，iPS研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已，然而，这才刚刚开始，iPS细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题。一方面iPS产生的方法有待改进；另一方面iPS细胞的定向分化手段需继续探索。斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞/iPS细胞技术平台，将竭力为全国各类进行干细胞/iPS研究的科研机构、高校、相关医疗机构和制药企业等提供高品质产品和优质的服务。目前，公司提供两种人类iPS细胞系，分别由4因子和6因子所诱导，方便科研工作者做后续的研究。细胞系名称货号SiDSH-01HIPS-01SiDSH-03HIPS-03另外，对于新手提供初学者试剂盒：名称货号包装人类胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒HESM-1KT1kit小鼠胚胎干细胞/iPS细胞胚胎初学者试剂盒MESM-1KT1kit人类诱导多能干细胞产生初学者试剂盒HiPS-1KT1kit小鼠诱导多能干细胞产生初学者试剂盒MiPS-1KT1kit这些产品都是经过严格的质控，为您科研的成功提供了基本的保证。2.人类胚胎成纤维细胞培养材料：人胚肺成纤维细胞：货号SDSC-07，SDSC-08规格1*106/支；人类胎儿包皮成纤维细胞：货号SDSC-17，规格1*106/支；0.25%trypsin：胰酶，Sidansai，货号M-005-1，M-005-2；含10%FBS的DMEM：成纤维细胞完全培养液，Sidansai，货号：EFM-01。实验步骤：人类成纤维细胞培养及传代方法基本与293T细胞相同。先吸弃废液，用0.25%Trypsin消化（一般T25瓶加1ml即可），放培养箱3－5分钟，待细胞大部分脱落时就可加含FBS的DMEM培养液终止消化，反复吹打至细胞至单细胞悬浮液即可。传代比例为1：3－1：5。Point此细胞系消化时间比293T细胞稍长，请不要在加入Trypsin后马上拍打使其脱落，否则会导致细胞结块，吹打不散。细胞传代比例大概为1：3-1：5，不能传得太稀，否则不易生长甚至停止生长。传代间隔时间为3－4天。3.重编程载体构建用于重编程的病毒载体，其构建方法与普通载体构建的方法基本相同，一般用慢病毒、腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体：质粒名称货号iPS慢病毒载体Lenti-oct4-GFPPlvO-01Lenti-sox2-GFPPlvO-02Lenti-cMyc-GFPPlvO-03Lenti-klf4-GFPPlvO-04Lenti-nanog-GFPPlvO-05Lenti-lin28-GFPPlvO-06Lenti-SV40LT-GFPPlvO-07iPS腺病毒载体Ad-Oct4-GFPpAD-01Ad-Sox2-GFPpAD-02Ad-cMyc-GFPpAD-03Ad-Klf4-GFPpAD-04Ad-Nanog-GFPpAD-05Ad-Lin28-GFPpAD-06Ad-Htert-GFPpAD-074.病毒包装材料：293T细胞：Sidansai，货号Plv-C-01转染试剂Fugene：Roche，货号4709713001实验步骤1．包装细胞铺板：①.传代293T细胞前将T75培养瓶用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，于37°C培养箱放置10min以上。②.传代293T细胞将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3min，取出，轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底，待其全部脱落，加入3mL37°C水浴中预热的培养液，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ulDMEM培养液，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。③.铺细胞前，用明胶包被的培养瓶取出，轻晃使明胶将瓶底完全覆盖，之后吸净剩余的明胶，即可将细胞铺上。细胞数量为1000万/T75，最后加新鲜培养液至总体积为10ml。）2.转染：第二天做转染前先观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。做脂转complex：OptiMEM需在37°C水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每瓶T75的complex成分如下：含cDNA的lv质粒：10ugpVSVG：5ugdelta8.91：7.5ugoptiMEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ulFugene转染试剂，加至optiMEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，最好隔2-4h后再取出培养瓶晃匀一次。3．收集病毒：转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％DMEM培养液10mL，即开始收集病毒。分别收集转染后48-96h的病毒上清，收集后可置于4°C冰箱短期保存。4．病毒滴度测定：收集病毒后即可测病毒滴度（悬浮感染）：①.在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul明胶）。②.消化293T细胞（步骤1.2），24孔板每孔铺被15万细胞。可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000polybrene（终浓度为10ug/mL），混匀，每孔加入500ul/15万细胞即可。③.将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。分别取2ul或者5ul病毒上清至上述步骤中的24孔板一孔中，摇匀后放入培养箱中。48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。5．病毒滴度确定：①.15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。②.将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘