二苯胺分光光度法测定发酵液中的二羟基丙酮

1二苯胺分光光度法测定发酵液中的二羟基丙酮李华，刘宇鹏，孙杨，周中赛（河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475004）摘要：本研究建立了甘油为底物发酵液中二羟基丙酮的分光光度检测方法。考察显色剂的用量、反应温度、反应时间、显色稳定时间、发酵液成分和发酵液中菌体自溶物等对测定的影响。该方法的相关系数R2=0.999，检测范围0.1～0.4g/l，样品回收率达102.4%，测定结果不受发酵液中甘油及其它杂质影响，具有快速准确的优点。关键词：分光光度法；二苯胺；1,3-二羟基丙酮Determinationof1,3-DihydroxyacetoneinFermentationBrothbyDiphenylaminespectrophotometryLIHua,LIUYu-peng,SUNYang,ZHOUZhong-sai(InstituteofBiotechnology,CollegeofLifeScience,HenanUniversity,Kaifeng475004)Abstract:Aspectrophotometrymethodwasestablishedforthedeterminationof1,3-dihydroxyacetoneofthefermentationbrothusingglycerol.Severalfactorsinfluencingthedeterminationwerestudied,suchastheamountofcolorreagent,reactiontemperature,reactiontime,colorstabilitytime,brothcompositionandcellautolysisinthebroth.Thedetectionlimitsandrecoveryratewere0.1～0.4g/l(r2=0.999)andtheaveragerecoverwas102.4%,respectively.Theresultsshowedthatglycerolandotherimpuritiesinthefermentationbrothhavenosignificantinterferencestothedeterminationof1,3-dihydroxyacetone,andthismethodprovedtobefastandaccurate.KeyWords:spectrophotometry;diphenylamine;1,3-dihydroxyacetone二羟基丙酮(1,3-dihydroxyaceton，简称DHA，1)是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，对人体和环境无毒害，可食用。1是一种重要的医药中间体，也可作为一种抗病毒试剂[1]。1能与皮肤最上层物质（如角质层内的氨基酸）发生Maillard反应使皮肤达到棕色到深色的染色效果。根据这一原理1在临床上被广泛应用于治疗白癫风[2]，它也被用来做为混合型卟啉病的保护剂[3]。还有研究表明在紫外照射下1能延缓皮肤癌变[4]。1的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法，国外比较成熟的工业生产主要是用含有甘油脱氢酶的微生物以甘油底物发酵生产。目前，发酵液中1检测方法有气相色谱法[5]、高效液相色谱法[6]、薄层层析法[7]。气相色谱法测定时1不能直接汽化，需要进行衍生化，操作繁琐；液相也比较耗时。薄层层析法只能定性分析，无法精确定量。在酸性溶液中1的酮基与二苯胺（diphenylamine，2）的氨基发生反应生成蓝色复合物，在608nm处吸光度与1的浓度呈线性关系，在酸性条件下，2不与甘油发生反应。本文根据这一原理建立了一种准确、简便、灵敏的以甘油为底物发酵液中1的比色检测方法。目前国内尚未有专门文献对22分光光度法测定1的系统研究报道。OHOOH1,3-DihydroxyacetonNHdiphenylamine＋蓝色复合物H+图12分光光度法反应原理1仪器与试剂TU-1201型紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器设备有限公司）；1512型高效液相色谱仪（美国Waters公司）。1（BioBasic公司）；2（上海试剂三厂）；无水乙酸；浓硫酸；甘油；酵母粉；磷酸二氢钾。菌种：葡糖杆菌Gluconobactersp.HD410，由河南大学生物工程研究所筛选并保藏。发酵培养基成分：甘油10%，酵母粉1.5%，无水KH2PO40.5%，pH自然。2方法与结果2.1溶液配制1溶液：准确称取11g，于1000ml容量瓶中定容，制成1g/l母液，分别加蒸馏水配制成0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5g/l的1梯度溶液。2溶液：准确称取20.6g，量取无水乙酸54ml边搅拌边加入浓硫酸6ml，混匀后加入称取的2，至完全溶解后密封保存。2.22分光光度法测定1标准曲线绘制：分别取0.5ml1梯度溶液，4.5ml2溶液，于比色管中沸水浴14min，流水冷却。以不含1的溶液为空白参比，608nm处测样品的吸光值。每个样品三次重复，取平均值。发酵液1含量测定：取对数期种子液，按5%的接种量接入摇瓶。200r/min，28°C发酵3~4d，取发酵液1.5ml，8000g离心10min。取上清液0.5ml用蒸馏水稀释100倍，取0.5ml稀释液加入4.5ml2溶液，沸水浴14min，流水冷却。以未接种发酵液为空白，在608nm处测吸光值，根据标准曲线计算发酵液中1含量。2.3HPLC测定1条件[6]色谱分离柱：BioRad公司AminexHPX-87H色谱柱（300mm×7.8mm,9μm）；RI检测器；UV检测器(检测波长215nm)；流动相：8mmol/l硫酸；柱温50℃；流速0.5ml/min；进样量20μl。2.4甘油浓度测定用高碘酸氧化法[8]测发酵液中甘油的含量。2.5测定条件研究2.5.1测定波长的选择3按2.2方法以蒸馏水为空白参比扫描不同1浓度400～700nm的吸收光谱。每个样品三次重复。图2是保持同样的的2溶液浓度，仅改变1浓度得到的一系列吸收光谱。从图2中可以看出，在608nm波长处显色反应有最大吸收值，且吸光度的增加与1溶液浓度的增加成正比。尽管在405nm波长处显色反应也有吸收峰，但峰值较低，因而本法最终选择测定波长为608nm(OD608)。图2不同1浓度吸收光谱2.5.2显色剂用量的选择取0.2g/l1溶液0.5ml，分别加入含不同浓度的2溶液，显色反应后流水冷却，测定吸光度OD608。由图3A得出结论，2含量高于1%（w/v）时吸光值不再增加，用量过少导致1与其不能充分反应，所测结果比实际偏低，故本法最终选择的显色剂用量为1%（w/v）。图3A不同浓度2对吸光值的影响；B不同浓度浓硫酸含量对吸光值的影响；C不同温度对吸光度的影响；D反应时间对吸光值的影响42.5.3硫酸用量的确定在酸性条件下1才能与2结合，生成蓝色的复合物。由图3B得出结论，浓硫酸含量为10%时生成的蓝色复合物吸光值达到最大。浓硫酸加入量不足或过多均导致吸光值偏低，且硫酸加入量过多会使反应冷却后吸光值不稳定。2.5.4加热温度的选择常温下2与1反应很慢，图3C表明，在沸水浴条件下，生成的复合物吸光值最大，用冷水冷却后吸光值稳定。2.5.5加热时间的选择沸水浴条件下反应需一定的时间1才能与2充分反应，图3D表明，沸水浴14min后，吸光值最大，且吸光值稳定，有利于准确测定；随着加热时间的增加，吸光值略有降低，冷却后吸光值不稳定。因而，本法选用的沸水浴时间为14min。2.6测定方法的影响因素2.6.1显色稳定时间的选择取不同浓度1溶液与显色剂反应后，在不同时间测定吸光值，试样溶液在显色完成至12h内吸光值稳定，表明本方法显色稳定性良好。2.6.2相关影响因素研究取发酵72h的发酵液与未接种的培养基，8000g离心10min。取0.5ml未接种培养基，以水为空白对照测吸光值，培养基在OD608值为0。结果说明甘油和培养基中的杂质对该测定方法没有影响。量取1ml离心上清液，加入4ml无水乙醇[9]，摇匀，离心后吸上清加蒸馏水稀释100倍，测其吸光值。与未加乙醇沉淀蛋白质的发酵液相比，二者吸光值没有显著的差别。结果表明菌体自溶产生的可溶性蛋白对该检测方法影响不大。2.7线性范围及检测限按“2.2”项下方法分别配制不同浓度的1溶液进行标准曲线绘制，结果表明1的浓度在0.5g/l以内时，吸光度（A）与质量浓度（c）呈线性关系。1浓度为0.1～0.4g/l时，0.2≤OD608≤0.8，回归方程为A=0.00855+1.9095c(r2=0.999)，线性良好。2.8精密度、回收率及准确度实验取发酵液待测样品，按照10g/l和15g/l的量精密加入1，按“2.2”项下方法反应后测定1的含量（重复测定五次），结果见表1所示，本方法的平均回收率和RSD均在正常误差范围之内。表1精密度和回收率测定（n=5）样品1质量浓度（g/l）加标量ρ（g/l）总1量ρ（g/l）1回收量ρ（g/l）回收率%RSD%115.2110.0025.3615.15100.10.6815.0030.6415.64102.40.535此外，对样品还进行了分光光度法和HPLC法测定的对比实验，以测定该法的准确度。将含有不同浓度1（10~100g/l）的发酵液稀释后分别按照“2.2”和“2.3”项中方法分别进行测定。实验结果表明，两种方法的测量误差在2%以内，进一步证明本测定方法不受发酵液中甘油杂质的影响，具有相对较高的准确度。2.9发酵液中1浓度变化曲线的测定按照“2.2”项中的方法，测定发酵液中1浓度变化曲线，并同时测定甘油的浓度变化（方法见“2.4”项），结果如图4。从图中可以看出，随着发酵时间延长，底物甘油呈下降趋势，在微生物分泌的酶作用下被转化成产物1，108h时1产量达到64.5g/l，转化率达到79.6%（1/甘油，w/w）。图4甘油转化生成1曲线3.讨论本文建立了用2分光光度法测定甘油为底物的发酵液中1含量的方法。测定最佳波长选为608nm，2最佳浓度为1%（w/v）；沸水浴加热时间14min。该方法测定过程不受发酵液中甘油和可溶性蛋白影响，具有显色稳定、测量快速准确的优点，非常适合于微生物发酵法生产1工艺中的产物测定。参考文献：[1]RuchiM,SeemaRJ,AshokK.Microbialproductionofdihydroxyacetone[J].BiotechnologyAdvances,2008,26(4):293-303.[2]FesqH,BrockowK,StromK,etal.Dihydroxyacetoneinanewformulation-apowerfultherapeuticoptioninvitiligo[J].Dermatology,2001,203(3):241-243.[3]LevySB.Cosmeticsthatimitateatan[J].DermatolTher,2001,14(3):215-219.[4]PetersenAB,NaR,WulfHC.Sunlessskintanningwithdihydroxyacetonedelaysbroadspectrumultravioletphotocarcinogenesisinhairlessmice[J].MutationResearch/GeneticToxicologyandEnvironmentalMutagenesis,2003,542(1):129-138.[5]张智宏,孙晓娟.二羟基丙酮的气相色谱分析[J].分析测试学报,1999,18(3):69-71.[6]饶志明,徐美娟,诸葛健等.高效液相色谱测定发酵液中1,3-二羟基丙酮(DHA)方法的建立[J].中国生物工程杂志,2008,28(1):6l-64.[7]ShigekiY,KoichiN,NobuhikoI.Fermenta