从RNA到电泳鉴定-研究进展之十七

2007春季研究进展徐百耀2007.04.20I研究进展之十七从RNA到电泳鉴定一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板，用VI型胶原蛋白的α1链的编码序列的特异性引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2）Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅2007春季研究进展徐百耀2007.04.20II占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3）特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR实验。二、引物设计引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用ΔG值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexormationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内2007春季研究进展徐百耀2007.04.20III切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料[24]，引物设计应注意如下要点：1）引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。3）引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4）引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是2007春季研究进展徐百耀2007.04.20IV最邻近法(thenearestneighbormethod)。6）ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列。三、总RNA提取如果使用试剂盒，则根据kit的使用说明就可以。也可使用传统的单试剂方法。但是需要注意以下几个问题。注意RNA的降解：RNA降解的可能性很大，但是并不可怕。书上要求塑料耗材需要用DEPC浸泡过夜后高压灭菌。如果使用的是一次性的塑料耗材，可以直接高压灭菌用于实验。使用的蒸馏水需要配成0.1%DEPC水过夜后高压灭菌。操作过程，尽量不要交谈，可以不带口罩。2007春季研究进展徐百耀2007.04.20V注意DNA的污染：细胞裂解后离心，取样时需要小心，只能取上清夜，如果取到中间层则可能引起DNA的污染。RNA完整性的鉴定：一般我们使用的是琼脂糖凝胶电泳。由于我们使用的是公共设备，电泳槽及缓冲液中含有RNAase，所以需要用洗衣粉彻底清洗，并换新配置的TAE/TBE。否则会将电泳过程造成的讲解误认为是提取RNA过程中的降解。四、逆转录一般使用的是2步法。逆转录反应和聚合酶链式反2007春季研究进展徐百耀2007.04.20VI应。使用试剂及耗材：AMV或使用MMLV，我们实验一般使用的是AMV，MMLV用于扩增长片段，AMV扩增长度一般小于2000bp。AMV价格在300元左右（200U），一次使用5U；RT-buffer10×购买时AMV配送；RNAaseInhibitor:50U/50ul体系使用的浓度为10U/ul1000U价格在120左右；OligodT18公司合成合成价格（1.5元/bp生工）；dNTP10mM配置后的浓度为200μM。价格一般为80元/ml以下是配置50ul反应体系，配置体系的大小根据后续实验需要的cDNA的量来决定：OligodT-----------------------3ulTotalRNA--------------------7ulRT-buffer----------------------5uldNTP--------------------------2ulRNAase-I---------------------5ul3dH2O---------------------27.5ulAMV------------------------0.5ultotal50ul取一支PCR管，加入7ul的TotalRNA（根据RNA2007春季研究进展徐百耀2007.04.20VII浓度决定）和3ul的OligodT，在水浴锅中70℃10分钟使之充分变性。然后取出PCR管并放入冰块中10分钟，骤冷退火。使OligodT与mRNA配对结合。然后加入3dH2O、RNAase-I-、dNTP、RT-buffer，最后加入AMV。42℃延伸40分钟（如果mRNA有复杂的二级结构，延伸中途可以将PCR管重新放到70℃水浴）。最后94℃灭活AMV。即得到所有mRNA的cDNA。mRNA只占总RNA的1-5%。五、聚合酶链式反应以下是配置50ul反应体系，配置体系的大小根据后续实验需要的目的DNA的量来决定。反应体系不能简单乘以倍数。引物稀释：n摩尔数×200=稀释体积（µl）cDNA----------------------------2µldNTP-----------------------------1µl10×PCR-buffer---------------5µl上引-----------------------------1µl下引-----------------------------1µlTaq--------------------0.5µl(2.5U)3dH2O------------------------39.5µlTotal50µl2007春季研究进展徐百耀2007.04.20VIIITaq一般60元/500单位10×PCR-buffer和6×loadingbuffer均有配送。注：所有塑料耗材高压灭菌，55℃干燥。实验中勤换枪头，最好吸一次换一次。避免试剂的交叉污染。注意移液枪是否吸有试剂，吹打是否完全。否则以为加了试剂，其实没有加到足量的试剂，影响反应体系。建议：实验中先加3dH2O，即方便加试剂又容易是试剂混合，最后加Taq。如果增加特异性性可以使用巢式PCR或TouchdownPCR；如果需要测mRNA需要使用3’race(rapidamplificationofcDNAends)和5’race。六、电泳鉴定电泳试剂及步骤详见研究进展之六使用不同的marker和目的条带的大小选择合适的凝胶浓度。浓度太小则marker跑不开。如果两个条带相差不大也跑不开。EB浓度不要太大否则成像时背景噪音污染较大。成像时载物台的保鲜膜不要太皱，否则图像很难看。电泳时电压不宜过大，电压5V/cm。我们一般使用100V电压,跑胶时间不能太长，否则会跑跳海一般30－40分钟。溴酚蓝的位置在500bp左右，可以根据溴酚蓝的位置判断跑胶是否完成。2007春季研究进展徐百耀2007.04.20IX徐百耀2007-4-20