仪器分析实验指导书

实验四反相高效液相色谱法测定水产品中土霉素和四环素残留量一、实验目的1.了解反相高效液相色谱的组成与分离原理；2.了解高效液相色谱仪的基本操作；3.掌握HPLC定性、定量方法；4.了解水产品样品的前处理方法。二、实验原理在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体，经酸化处理后与含烷基(C8、C18)或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。反相色谱的分离机制有多种，但多倾向于吸附色谱的作用机制。吸附色谱的作用机制认为，溶质在固定相上的保留是疏溶剂作用的结果(即所谓的疏溶剂理论)。根据疏溶剂理论，当溶质分子进入极性流动相时，即占据流动相中相应的空间而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动与固定相接触时，溶质分子的非极性部分(或非极性分子)会将附着在非极性固定相上的溶剂膜挤开，直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合络合物，构成单分子吸附层，而极性部分暴露在溶剂中。这也就是说溶质分子和固定相之间的“结合”，是由于溶质和极性溶剂之间的斥力造成的，而不是非极性溶质和非极性固定相之间的微弱的非极性作用力的缘故。这种疏溶剂斥力作用中可逆的，当流动相极性减弱时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并将溶质分子释放而被洗脱下来。所以，流动相的极性越强，缔合作用就越强。显然，烷基键合固定相对每种溶质分子缔合作用和解缔作用之差，就决定了溶质分子在色谱过程中的保留值。三、仪器与试剂HPLC色谱仪（DAD检测器）、分析天平（0.0001g）、均质器、固相萃取仪、高速离心机等。乙腈：色谱级；土霉素、四环素：标准品；磷酸氢二钠、磷酸、高氯酸、甲醇、EDTA-2Na、正己烷：分析级；水：超纯水；微孔滤膜：0.45μm。四、实验步骤1、色谱条件色谱柱：反相C18柱；检测器：PDA、检测波长355nm；柱温：37℃；流速：1.0mL/min；进样量：30μL；流动相：乙腈：磷酸二氢钠（0.01mol/L）=26：74。2、标准溶液的配制0.01mol/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56g（准确至0.01g）磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）溶于蒸馏水中，定容至1000mL，以磷酸调pH至2.5，经微孔滤膜（0.45μm）过滤后备用。土霉素、四环素标准溶液：分别称取土霉素、四环素各0.01g，分别用于0.01mol/L磷酸二氢钠溶液中，定容至100.0mL，此标准溶液每毫升含土霉素、四环素100μg。土霉素、四环素标准使用溶液：移取上述标准溶液10.0mL，定容至100.0mL，得土霉素、四环素浓度分别为10μg/mL的标准使用溶液。以上述标准溶液配制系列标准使用浓度：0.05、0.10、0.20、0.25、0.50、1.0μg/mL。此标准使用溶液需现配现用。3、样品处理鱼去鳞、去皮沿背脊取肌肉；虾去头、去壳取可食肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分；样品切为不大于0.5×0.5×0.5cm的小块后混匀。称取5.000g±0.001g样品，置于50mL离心管中，加入0.5%高氯酸溶液10mL（水溶性蛋白含量高的样品，用1.0%高氯酸溶液），用均质器均质30s，于震荡器上振荡提取30min，以4000r/min离心10min，取上清液于50mL试管中，向离心管中的残渣再加入0.5%高氯酸溶液5mL，重复操作一次，合并上清液。加入1mL正己烷，振荡1min后，离心，除去正己烷相；再加入1mL正己烷，振荡1min后，离心，除去正己烷相。水相用ODS-C18柱（预先用5mL甲醇、2mL5.0%乙二胺四乙酸二钠溶液、5mL实验用水洗过）预处理，用10mL蒸馏水洗去杂质，以5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴中氮气吹干，用甲醇定容至1.0mL，以微滤膜过滤，滤液备用。4、测定1）开机按照正确开机方式，分别开启工作站、高效液相色谱仪和检测器，并联机，预热；用流动相冲洗系统和进样环，待基线稳定。2）建立分析方法先配置系统，empower节点中选择系统配置，建新项目和方法。3）进样分析按照浓度有低到高的顺序测定标准系列溶液，在相同的实验条件下分别分析标准溶液和样品溶液，进样量均为30μL。4）关机测定完毕后，用100%甲醇清洗色谱柱和进样环，按照操作步骤先关闭电脑后关高效液相设备，并清洗所用玻璃仪器。五、结果处理1、由土霉素、四环素的标准色谱图对土霉素、四环素进行定性分析。2、根据土霉素、四环素的色谱峰面积绘制标准工作曲线。3、有标准工作曲线和样品中土霉素、四环素的峰面积，计算滤液中的土霉素、四环素的浓度。4、样品中土霉素、四环素的含量按下式计算：mVcX/式中：X—样品中抗生素含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c—样品溶液中抗生素含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；m—样品质量，单位为克（g）；V—样品溶液体积，单位为毫升（mL）。六、注意事项1、样品制备后一定要微滤后才能进样；2、流动相进入仪器前一定要微滤和超声脱气；3、仪器要先充分预热、再用流动相冲洗系统，待基线稳定后再进样。七、思考题1、流动相使用前为什么要脱气？2、内标法和外标法定量法的优缺点是什么？实验五HPLC法测定果汁中有机酸的含量一、实验目的1、了解饮料样品的前处理方法；2、掌握果汁中有机酸种类的HPLC定性、定量方法。二、实验原理样品经处理、离心后，样液经0.45μm滤膜抽滤，以(NH4)2HPO4-H3PO4缓冲溶液（pH=2.7）为流动相，用高效液相色谱法在C18色谱柱上分离，于210nm处经紫外检测器检测。有机酸在两相中分配分离，按照其碳原子数由少到多的顺序从色谱柱中洗脱下来，用峰高或峰面积标准曲线测定有机酸的含量。三、仪器与试剂HPLC色谱仪（DAD检测器）、移液器、固相萃取仪、高速离心机等。(NH4)2HPO4、H3PO4、乙醇：分析级；柠檬酸、酒石酸、苹果酸：标准品；水：超纯水；微孔滤膜：0.45μm。四、实验步骤1、色谱条件色谱柱：C18；检测器：PDA、检测波长210nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；流动相：0.01mol/L磷酸氢二氨，用1.0mol/L磷酸调至pH=2.70，临用前超声波脱气。2、有机酸标准储备液的制备：称取柠檬酸、酒石酸各0.5000g；丁二酸0.1000g；用超纯水溶解后，定溶至50mL。柠檬酸、酒石酸的浓度分别为10.0mg/mL，丁二酸为2.0mg/mL，此液为标准储备液。3、有机酸标准使用液的制备：取5.00mL标准储备液于50mL容量瓶中用超纯水稀释至刻度。柠檬酸、酒石酸的浓度分别为1.0mg/mL，丁二酸为0.2mg/mL。4、样品处理：准确吸取5.00mL试样（若试样中含二氧化碳应先加热除去；若试样中含有人工合成色素应先加入聚酰胺粉于70℃水浴中加热脱色，样液在3000r/min下离心10min，再取上清液），加入0.2mL1mol/L磷酸，用超纯水稀释至10mL，经0.45μm滤膜过滤，滤液供分析用。5、测定（1）开机按照正确开机方式，分别开启工作站、高效液相色谱仪和检测器，并联机，预热；用流动相冲洗系统和进样环，待基线稳定。（2）建立分析方法先配置系统，empower节点中选择系统配置，建新项目和方法。（3）进样分析按照浓度有低到高的顺序测定标准系列溶液，在相同的实验条件下分别分析标准溶液和样品溶液，进样量均为20μL。（4）关机测定完毕后，用100%甲醇清洗色谱柱和进样环，按照操作步骤先关闭电脑后关高效液相设备，并清洗所用玻璃仪器。五、结果计算1、由柠檬酸、酒石酸的标准色谱图对柠檬酸和酒石酸进行定性分析。2、根据柠檬酸、酒石酸的色谱峰面积绘制标准工作曲线。3、有标准工作曲线和样品中柠檬酸、酒石酸的峰面积，计算滤液中的柠檬酸、酒石酸的浓度。4、样品中柠檬酸、酒石酸的含量按下式计算：VVcX1式中：X—试样中有机酸的含量，单位为毫克每升（mg/L）；c—由标准曲线或线性回归方程中求得样液中某有机酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V1—试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）；V—试样为用于分析的试样体积，单位为毫升（mL）。六、注意事项1、样品制备后一定要微滤后才能进样；2、流动相进入仪器前一定要微滤和超声脱气；3、仪器要先充分预热、再用流动相冲洗系统，待基线稳定后再进样。七、思考题流动相使用前为什么要脱气？高效液相色谱原理简介高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法：采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法:一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐