人参皂甙Rh2致MCF7ADM凋亡的实验研究

人参皂甙Rh2致MCF-7/ADM凋亡的实验研究张晖1,2,孔棣2,吴咸中2,张会来3,王华庆31天津医科大学博士研究生(天津300070)2天津市中西医结合急腹症研究所3天津医科大学肿瘤医院出处：中国中西医结合外科杂志2007年6月第13卷第3期摘要目的:本实验旨在研究Rh2对肿瘤细胞生长的抑制作用及其机理,以进一步阐述Rh2在抗肿瘤方面的作用。方法:Rh2作用于MCF-7及MCF-7/ADM细胞,应用MTT法确定各组细胞增殖抑制率。流式细胞仪分析Rh2导致MCF-7和MCF-7/ADM细胞坏死及凋亡的作用,及其对细胞周期的影响,并检测Rh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞内Caspase3活性的影响。结果:Rh2可以显著抑制MCF-7和MCF-7/ADM的增殖(P0105),并有时间和剂量依赖关系,对MCF-7抑制作用更强。Rh2可以导致MCF-7坏死,通过Caspase途径诱导MCF-7/ADM凋亡(P0105),对两种细胞周期的影响也有所不同。结论:人参皂甙Rh2通过不同机制抑制了MCF-7和MCF-7/ADM细胞的增殖,Rh2促进耐药细胞系MCF-7/ADM凋亡的研究结果显示其在抗肿瘤作用方面的独特性。关键词:人参皂甙Rh2;MCF-7细胞系;增殖抑制;凋亡中图分类号:R28515文献标识码:A文章编号:1007-6948(2007)03-0261-04ApoptoticEffectsofGinsenosideRh2onDrugResistanceHumanMammaryAdenocarcinomaMCF27/ADMCellsZhangHui,KongDi,WuXianzhong,etal.TianjinMedicalUniversity,Tianjin(300070),ChinaAbstract:ObjectiveToresearchonthemechanismofinhibitoryeffectofginsenosideRh2onhumanmammaryadenocarcinomaMCF27andthedrugresistancecelllineMCF27/ADMinvitroMethodsInMTTtests,Rh2wereaddedtoMCF27andMCF27/ADM,inhibitionratiosweredetermined.Inflowcytometricanalysis,necroticandapoptoticffectofRh2onMCF27andMCF27/ADMweredetermined.EffectsofRh2oncellcycleweredeterminedtoo.Theactivityofcaspase3inMCF27andMCF27/ADMcelllineswasalsodetected.ResultsGinsenosideRh2couldinhibitthepro2iferationofMCF27andMCF27/ADMcellswithtimeanddose2dependent(P0.05),Rh2hadstrongereffectonMCF27cells.Rh2couldcausenecrosisonMCF27,andinduceapoptosisonMCF27/ADMwithCaspasepathway.TheeffectsofRh2onCellcyclesonMCF27andMCF27/ADMweredifferenttoo.ConclusionGinsenosideRh2caninhibitthepro2liferationofMCF27andMCF27/ADMcellswithdifferentmechanism.Rh2showedindividualityonanti2tumoreffects.Keywords:ginsenosideRh2,MCF27cellline,inhibitionofproliferation,apoptosis近年来的研究发现,我国的名贵中药人参具有抗癌活性,其主要活性成分人参皂甙(ginsenoside,GS)能诱导细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用。其中Rh2是从红参中提取的天然活性成分,属二醇组皂甙。国内外一些学者先后报道Rh2对多种肿瘤细胞如小鼠黑色素瘤B16细胞、C6胶质瘤细胞、人肝癌细胞SK-HEP-1等具有增殖抑制和诱导凋亡作用[1-7]。本实验以人乳腺癌细胞系MCF-7为受试对象,研究Rh2对肿瘤细胞生长的抑制作用及其机理,旨在进一步阐述Rh2在抗肿瘤方面的作用。1材料与方法1.1试剂与仪器Rh2购自吉林大学基础医学院化学教研室,纯度98%,溶于二甲基亚砜(DMSO),制成20mg/mL母液备用;MTT购自Sigma。RPMI1640培养基为美国Invitrogenlifetechnologies公司产品;胎牛血清为美国Gibco公司产品。酶标仪为BioTek1SynergyHT,流式细胞仪为Beckmancoulter1EPICS1XL型。1.2细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7由天津医科大学肿瘤医院免疫室提供,培养基为含10%胎牛血清的RPMl1640培养液,置于37℃,5%CO2的湿化培养箱中培养。同时,于培养基中加入逐渐增加剂量的阿霉素而筛选出耐药细胞系MCF-7/ADM,其培养基为含015mg/L阿霉素的10%胎牛血清RPMl1640培养液。1.3细胞毒实验采用MTT法,取对数生长期细胞,用胰酶消化成细胞悬液接种于96孔板中,每孔1×104,加入不同浓度Rh2,每组设3个复孔,实验重复3次。孵育20h、44h、68h后分别加入MTT,继续孵育4h后离心弃上清,加入DMSO,再孵育30min后震荡,用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度值(A值)。细胞生长抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%1.4细胞凋亡检测人参皂甙Rh2被设为3个浓度梯度:10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L。0μmol/L为对照组。取对数生长期MCF-7和MCF-7/ADM细胞,用胰酶消化成细胞悬液种入6孔板中,每孔按预设终浓度加入Rh2,37℃、5%CO2孵箱中孵育24h。重新消化细胞后,4℃离心,预冷的PBS洗细胞两次,冰浴上用预先稀释的结合缓冲液重新悬浮细胞于5mL流式管中,调节其浓度为5×106/mL。加入AnnexinV/FIFC和碘化丙锭。混匀后于室温避光孵育15min。上流式细胞仪分析。1.5细胞周期检测实验取对数生长期细胞,用胰酶消化成细胞悬液种入6孔板中,每孔按预设终浓度加入Rh2,37℃、5%CO2孵箱中孵育24h。重新消化细胞后,4℃离心,预冷的PBS洗细胞两次,95%乙醇固定过夜。加入PI(50μg/mL)和RNase(50μg/mL)的混合液。室温避光孵育30min,上流式细胞仪检测分析。1.6Caspase3活性实验细胞分为7个实验组:(1)MCF-7。(2)MCF-7+40μmol/LRh2。(3)MCF-7+40μmol/LRh2+CaspaseInhibitor(Z-VAD-FMK)。(4)MCF-7/ADM。(5)MCF-7/ADM+40μmol/LRh2。(6)MCF-7/ADM+40μmol/LRh2+CaspaseInhibitor(Z-VAD-FMK)。(7)试剂对照组。每组37℃、5%CO2孵箱中孵育16h,收集细胞,冷PBS液洗2遍,弃上清。加入细胞裂解液,反复冻融以裂解细胞,4℃离心,15000×g,20min,收集上清液,按试剂盒步骤进行Caspase3活性检测。1.7统计学分析实验结果以.x±s表示,两组之间比较采用t检验,P0105为具有显著性差异。2结果2.1Rh2对MCF-7及MCF-7/ADM细胞生长的抑制作用结果显示,Rh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞的生长均有抑制作用,且呈现剂量依赖关系和时间依赖关系。Rh2对MCF-7的增殖抑制作用更强,其72hIC50在10μmol/L～20μmol/L之间,24hIC50在40μmol/L～80μmol/L之间;而Rh2对MCF-7/ADM的72hIC50在40μmol/L～80μmol/L之间,24hIC50则80μmol/L(表1、表2)。2.2Rh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞凋亡及坏死的影响结果显示,20μmol/L和40μmol/LRh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞均有致凋亡作用,并有剂量依赖关系,致MCF-7/ADM细胞的凋亡作用更强。Rh2对MCF-7细胞的抑制作用主要是导致其坏死(表3)。2.3Rh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞周期的影响实验结果显示,Rh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞周期的影响有所不同。在MCF-7细胞中,是使细胞周期阻滞于S期,G2/M期细胞减少;而在MCF-7/ADM细胞中,趋势却相反,Rh2导致S期细胞减少,G2/M期细胞增多(表4、表5)。表1Rh2对MCF-7细胞生长的抑制作用Rh2浓度24hA(.x±s)抑制率(%)48hA(.x±s)抑制率(%)72hA(.x±s)抑制率(%)对照组01399±01010———01660±01041———01768±01050———5μmol/L01360±01035917701556±0105515171△01670±010071217210μmol/L01363±01030911101557±0104715161△01448±0103441160△20μmol/L01363±01038911101519±0105421131△01255±0101866183△40μmol/L01206±0100348137△01170±0101274124△01193±0101674182△80μmol/L01160±0101359198△01122±0102481146△01188±0100875151△注:与对照组比较,△P0105表2Rh2对MCF-7/ADM细胞生长的抑制作用Rh2浓度24hA(.x±s)抑制率(%)48hA(.x±s)抑制率(%)72hA(.x±s)抑制率(%)对照组01260±01010———01295±01020———01458±01043———5μmol/L01236±01007911101237±0101619186△01379±0104817126△10μmol/L01236±01023911101233±0100721122△01345±0104224169△20μmol/L01235±01011913701233±0102621111△01289±0104036178△40μmol/L01223±010121411201192±0101734199△01246±0107946117△80μmol/L01138±0100746185△01123±0101658124△01202±0106255179△注:与对照组比较,△P0105表4Rh2对MCF-7细胞周期的影响Rh2浓度G0/G1期(%)S期(%)G2/M期(%)0μmol/L58101619251020μmol/L60181715211740μmol/L561026171714表5Rh2对MCF-7/ADM细胞周期的影响Rh2浓度G0/G1期(%)S期(%)G2/M期(%)0μmol/L61171316241720μmol/L6414918251840μmol/L631261230162.1Rh2对MCF-7和MCF-7/ADM细胞Caspase3活性的影响实验结果显示,与MCF-7/ADM细胞对照组相比,经40μmol/LRh2作用后,该组pNA释放量明显增加(P0105),而同时加入Caspase3抑制剂Z-VAD-FMK组,pNA释放量则明显低于40μmol/LRh2组(P0105),从而说明Rh2通过Cas2pase途径促进了MCF-7/ADM细胞凋亡。在MCF-7细胞