蛋白质印迹手册2015

蛋白印迹技术手册（第六版）•基本原理•操作详解•经验技巧•疑难解答•常用工具默克密理博生命科学部密理博(Millipore®)公司成立于1954年，总部位于美国麻省，主要生产膜及以膜为核心的衍生产品。2010年默克集团成功并购密理博公司，成立了新的具有强大创新能力默克密理博部门，为全球生命科学用户提供更加有效的解决方案和完整的产品线。膜的传奇还在继续……默克密理博的膜技术产品全面支持您的高效生命科学研究Millex®针头式过滤器适合～200mL样品过滤、除菌以外观颜色区分膜材质（PES绿，PVDF黄，MCE蓝等）直径、膜材质、膜孔径、包装规格齐全行业领先：最快：MilliporeExpress®PLUSPES系列蛋白结合损失最低：Durapore®PVDF系列Stericup®/Steritop®过滤器适合150～1000mL培养基过滤、除菌膜孔径、包装规格齐全精巧设计带来满意体验行业领先：最快：MilliporeExpress®PLUSPES系列蛋白结合损失最低：Durapore®PVDF系列Amicon®Ultra超滤管用于蛋白、核酸、病毒、微粒等快速浓缩、除盐及换液处理体积、截留分子量、包装规格齐全行业领先：再生纤维素膜蛋白结合损失最低双竖膜、死体积及反转回收等精巧设计带来满意体验Millicell®悬挂式/站立式细胞培养小室细胞/组织立体培养，细胞运动，共培养和结合实验等膜孔径、膜材质、包装规格齐全行业领先：PET悬挂式操作最方便PCF站立式文献引用率高Immobilon®转印膜Blotting技术的基石，Western必备高载量，兼容各种检测方法行业领先：0.45μm最经典的通用转印膜0.22μm载量最高，适合20kDa和低丰度蛋白检测FL特别改良用于荧光检测，背景低于NC膜MultiScreen®高通量滤膜板符合自动化操作规范，性能稳定，数据可比性好行业领先：亲水性PVDF膜蛋白结合损失最低疏水性PVDF膜蛋白载量最高，ELISpot专用超滤膜板用于大分子高通量操作膜技术行业标杆产品默克密理博微滤——去除颗粒物，除菌MilliporeExpress®PLUSPES膜——过滤速度最快•Millex®针头式过滤器：处理体积～200mL，直径33mm规格系列最常用（cat#SLGP033RB等）•Steriip®过滤器：处理体积50mL•Stericup®/Steritop®过滤器：处理体积150mL-1L（cat#SCGPT05RE，cat#SCGPT10RE，cat#SCGPU05RE）•Sterivex®过滤器：处理体积2L（cat#SVGPL10RC）•Stericap®过滤器：处理体积2-10Lcat#SCGPCAPRE•Steripak®过滤器：处理体积10-20Lcat#SPGPM10RJcat#SPGPM20RJ亲水性Durapore®PVDF膜——蛋白吸附最低，含蛋白样品过滤首选•Millex®针头式过滤器：处理体积100mL，直径33mm规格系列最常用（cat#SLHV033RB等）•Steriip®过滤器：处理体积50mL（cat#SE1M003M00）•Stericup®/Steritop®过滤器：处理体积150mL-1L（cat#SCHVU11RE等）•Sterivex®过滤器：处理体积1L•Ultrafree®系列离心微滤管：处理体积0.5或2mL，提供预除菌形式包装MCE（混合纤维素）膜——经典常用膜•Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径可供选择亲水性PTFE膜——化学耐受性最好•Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径可供选择•Ultrafree®系列离心微滤管：处理体积0.5或2mL，提供预除菌形式包装疏水性Durapore®PVDF膜及疏水性Fluoropore®PTFE膜——气体过滤，在线传感器保护•Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径/接头可供选择玻璃纤维膜——预过滤•Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径可供选择尼龙膜——预过滤，单细胞分离•Steriip®过滤器：多种孔径可供选择超滤——蛋白/核酸/病毒的浓缩、除盐、缓冲液置换再生纤维素膜——超低蛋白吸附超滤膜•Amicon®Ultra系列超滤管（cat#UFC901096等）•Amicon®Pro纯化超滤管：1mg以内蛋白样品操作新标准工具新！•D-tube™系列透析管：温和换液、浓缩、电洗脱•Microcon®系列超滤管：DNA、蛋白浓缩；法医刑侦专用•Centricon®Plus-70系列超滤管：15-70mL样品浓缩•StirredCell系列超滤杯：3-400mL高浓度样品温和浓缩，可换膜PES超滤膜——孔结构松弛，适合浓度/粘度高的样品•StirredCell系列超滤杯：3-400mL高浓度样品温和浓缩，可换膜细胞培养表面——三维生长，细胞运动，结合物分析PET（聚乙烯对苯二酸酯）膜：用于贴壁细胞的生长，无需胞外基质•Millicell®PET悬挂式细胞培养小室（cat#PIHT12R48，cat#PIRP12R48，cat#PIEP12R48）亲水性Isopore™PCF（聚碳酸酯）膜：用于贴壁细胞的生长，无需胞外基质•Millicell®站立式细胞培养小室（cat#PIHP01250，PI8P01250）•Millicell®24孔培养板（cat#PSHT010R5）亲水Biopore™PTFE（聚四氟乙烯）：低蛋白吸附、可进行活细胞观察以及免疫荧光等应用•Millicell®站立式细胞培养小室（cat#PICM03050，PICM01250，器官型PICM0RG50）高通量分析——小体积、多样品操作疏水性PVDF膜——蛋白吸附最好的膜，细胞因子高灵敏检测首选•MultiScreen®96孔板或8链条：用于亲和素-生物素相关分析、DNA结合蛋白分析、效应作用分析、蛋白互作分析等，是业界公认的ELISpot专用板（cat#MSIPS4510，M8IPS4510）亲水性PVDF膜——蛋白结合最低的膜•MultiScreen®96孔板：用于完整细胞/细胞部分受体结合分析，蛋白激酶/磷酸酶沉淀分析，珠子/树脂形式分析，新生儿（苯丙酮尿症）筛查（cat#MSHVN4550）•MultiScreen®96孔板：通过临床诊断应用验证，用于蛋白激酶/磷酸酶分析、样品制备、末端染料去除（测序用）（cat#MAHVN4550）亲水性PTFE膜•MultiScreen®96孔板：用于天然产物筛选，可溶性分析，总药物分析（cat#MSRLN0410）PCF膜•Millicell®96孔板：用于Caco-2细胞培养及细胞水平分析，包括细胞渗透性/粘附/培养/分化/药物转运等（cat#PSHT004S5）再生纤维素膜•MultiScreen®96孔板：用于蛋白浓缩、除盐、缓冲液置换（cat#MAUF01010）其它膜•MultiScreen®96孔或384孔板：用于纯化PCR产物、去除dNTPs和引物（cat#LSKMPCR10）印迹研究——对生物大分子有卓越的吸附能力疏水性PVDF转印膜——蛋白载量最大的膜•Immobilon®-P0.45μm最常用的WB转印膜（cat#IPVH00010）•Immobilon®-PSQ0.2μm小分子蛋白/肽WB转印膜（cat#ISEQ00010）•Immobilon®-FL0.45μm背景最低的荧光检测专用转印膜（cat#IPFL00010）硝酸纤维素（NC）转印膜•Immobilon®-NC0.45μm传统WB常用转印膜（cat#HATF00010）更好的膜，更好的印迹。关于第六版1.SouthernE.JMolBio1975;98:503.随着蛋白印迹手册第六版的出版，默克密理博公司一如既往地协助研究人员紧跟蛋白检测的前沿进展。我们在优化抗体浓度和降低背景方面增加了更全面的建议，同时扩展了荧光检测的数据和操作步骤。这本手册代表了我们应用科学家的集体经验和智慧——正是他们一直积极参与推进蛋白印迹和检测技术。这本手册也包含了我们技术服务专家团队所提供的许多最常见的建议，世界各地的科学家常常联系他们寻求帮助。近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领先供应商。1975年，E.M.Southern使用这些膜首次创建了从琼脂糖凝胶上转移核酸1。第一款用于Western印迹的0.45μm-PVDF基质，Immobilon®-P膜，在1985年面市，而第一款用于蛋白印迹和测序的0.2μm-PVDF基质，Immobilon®-PSQ膜，在1988年面市。除了Immobilon®膜和试剂，默克密理博还为蛋白研究提供了广泛的其它工具，包括温和高效的蛋白提取试剂盒，通过PureProteome™磁珠快速分离蛋白，以及通过Amicon®-Ultra离心超滤管高效浓缩除盐。从何处获得更多信息如果您有问题或需要协助，请联系默克密理博的技术服务专家团队：电话：400-889-1988-2分机邮箱：[e-mail]您还可以在中文ProMart蛋白研究产品超市网站上下载更多相关资料或查阅产品详情。目录蛋白印迹技术简介31膜的选择4Immobilon®PVDF转印膜2蛋白结合10Immobilon®-P还是Immobilon®-PSQ转印膜？影响蛋白结合的因素3印迹方法：原理与优化11过滤11Western印迹12在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白混合物分子量标准品聚丙烯酰胺的浓度凝胶电泳缓冲液蛋白从凝胶转移到膜上电转印技术转印缓冲液甲醇在转印缓冲液中的功能影响蛋白成功转移的因素SDS的存在电流和转印时间转印缓冲液的pH值平衡时间建立一种新的转印操作尝试建立蛋白鉴定的膜用于染色和免疫检测通过透照法观察和快速免疫检测保存透照染色可逆染料不可逆染料缓冲液封闭抗体清洗间接印迹检测底物蛋白观察4蛋白鉴定23免疫检测23标准或快速免疫检测步骤影响免疫检测的因素多轮杂交Immobilon®PVDF转印膜质谱分析29利用Immobilon®PVDF转印膜进行质谱分析1显色检测化学发光检测荧光检测2目录（续）5操作311蛋白转印的操作321.1电转印：槽转印1.2电转印：半干转印1.3斑点印迹/狭缝印迹：真空过滤法1.4Spot印迹：手工点样法1.5封闭试剂的优化1.6膜干燥方法1.7创新方法：间接印迹以避免二抗的非特异性结合2蛋白观察的操作412.1通过透照法观察2.2通过可逆染色观察丽春红CPTS（酞菁铜四磺酸）2.3通过不可逆染色观察考马斯亮蓝R染料氨基黑3免疫检测的操作443.1标准的免疫检测方法3.2快速的免疫检测方法3.3利用SNAPi.d.®2.0系统进行快速的免疫检测3.4高盐溶液清洗以去除顽固的背景4剥离膜上抗体的操作514.1通过加热和去污剂剥离4.2通过低pH条件剥离4.3利用ReBlot™PlusWesternBlotRecyclingKit剥离5蛋白消化的操作535.1消化膜上蛋白以便进行质谱分析6印迹膜保存的操作经验之谈：从容应对高难度WesternBlotting实例分析与建议专家之选——WesternBlotting常用工具546.1印迹膜制备以便长期保存6常见问题与改善建议55词汇表参考文献专利7附录66666874简介3自1979年被建立以来（Towbin等，1979）蛋白印迹已成为研究型实验室的一种常规方法。它通常用于检测复杂样品中的少量目的蛋白，或监控蛋白表达与纯化。最简单的蛋白印迹操作被称为斑点印迹或狭缝印迹，是用真空抽滤将蛋白转移到一块微孔膜上。尽管这种方法可提供蛋白整体表达水平的定量信息，并可以平行开展多个样品的检测，但它缺乏蛋白分子量的信息。同时特异性也会受影响，因为蛋白降解产物或翻译后修饰的异构体也能随着完整蛋白一起被检测。Western印迹是一种更为复杂的操作，它包含通过凝胶电泳来分离蛋白混和物，随后电转移到适当的膜（如PVDF）上。在蛋白转移至PVDF膜后，它们可被染色以便观察，也可直接通过N端测序、质谱分析或免疫检