细胞凋亡与检测原理

1细胞凋亡与检测方法2目录一细胞凋亡的定义二细胞凋亡的检测方法3一、细胞凋亡的检测方法细胞凋亡生理性凋亡病理性凋亡由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）非遗传控制的的意外的细胞坏死（accidentalcelldeath）定义：凋亡定义：细胞坏死4细胞坏死（细胞被动性死亡）细胞受到急性强力伤害时，立即出现的早期反应。是病理条件下细胞死亡的过程。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症细胞凋亡（细胞主动性死亡）多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD).从严格的词学意义上来说，PCD与凋亡是有很大区别的5细胞坏死细胞凋亡6二、细胞凋亡的检测方法形态学方法电泳法原位缺口末端标记法流式细胞术测定法7(二)形态学方法借助普通光学显微镜，荧光显微镜或透射电镜对培养细胞，细胞涂片或者组织切片进行形态学观察。细胞凋亡的形态特征分为3部分：凋亡的起始凋亡小体的形成凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞吞噬清除下面以碧云天生物技术公司生产的细胞凋亡-hoechst染色试剂盒为例8碧云天生产的细胞凋亡－Hoechst染色试剂盒(HoechstStainingKit)提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。典型的Hoechst33258染色后的细胞图片参考下图。正常细胞核刺激后有致密浓染的凋亡细胞9（三）电泳法在细胞凋亡时，内源性mg2+、ca2+依赖性核算内切酶被激活，对DNA的切割有3种形式。即核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂以及DNA单链的断裂。用胰酶消化体外培养细胞，经PBS洗涤，用蛋白K消化，酚-氯仿抽提凋亡细胞的基因组DNA，取5ug琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察可见特征的‘梯状’（ladder）DNA条带。该方法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系10TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling(TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法.细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA碎裂成片段(DNAfragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息.原位末端标记技术可以检测到形态改变之前的凋亡细胞，敏感性高，特异性强，为凋亡细胞计数提供了基础（四）原位缺口末端标记法1112（五）流式细胞术测定法利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。图为：BECKMANCOUTERFLOWCYTOMETER试剂盒采用赛宝生生物技术Annexin-v-FITCF凋亡检测试剂盒13流式细胞仪的工作原理和基本结构待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。流动室充满IsoFlow，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。14细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境稳定的方面起到十分重要的作用。AnnexinV是一种分子量在35-36kD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）高亲和力特异性结合。以标记FITC的AnnexinV作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。15PI(Propidiumiodide)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过而使细胞核染成红色。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。16散点图密度图二维等高图直方图17谢谢请大家批评指正