细胞凋亡实验

细胞凋亡与检测方法汇报人：凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。一、细胞的死亡方式二、细胞坏死与凋亡的比较坏死凋亡性质病理性、非特异性生理性或病理性，特异性诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生生化特点被动过程，无新蛋白质合成，不耗能主动过程，有新蛋白质合成，耗能DNA电泳形态变化弥散性降解，电泳呈均一DNA片状细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀DNA片段化（180—200bp），电泳呈“梯”状条带胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应凋亡小体无有基因调控无有三、细胞凋亡的生理意义1.确保正常发育、生长如：指（趾）间隙的形成2.维持内环境稳定如：清除受损、突变或衰老的细胞3.发挥防御功能如：使受到病毒感染的细胞凋亡细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化凋亡小体初期：核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小中期：胞膜内陷出芽浓缩核裂解膜自行分割后期：邻近的上皮细胞、MΦ、瘤细胞等吞噬凋亡小体四、凋亡时细胞的主要变化（一）形态学改变NormalCellApoptoticcell（二）、生化改变１、DNA片段化－主要特征2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活内源性核酸内切酶的作用H1核心颗粒连接区180-200bp内源性核酸内切酶Zn2+Ca2+Mg2+五、细胞凋亡的检测方法1、形态学检测•（一）HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状）•（二）透射电镜观察•（三）荧光显微镜观察透射电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。荧光显微镜•Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）2、DNA片断化检测•细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成3、流式细胞仪检测flowcytometer•（一）PI单染•（二）Annexinⅴ/PI双染色（一）PI单染•荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。•细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。•乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。•判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）AB（二）Annexinⅴ/PI双染色•原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。•PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。•两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏,•可用PI区分。•检测标准：•早期凋亡细胞：Annexinⅴ-FITC(+)；PI(-)；•坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：•Annexinⅴ-FITC(+)；PI(+)；•机械性坏死及非特异性染色：•Annexinⅴ-FITC(-)；PI(+)；•正常细胞：Annexinⅴ-FITC(-)；PI(-)；C-mycASO200nmol/L凋亡结果坏死结果4、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。•亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590nm）.•JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590nm，线粒体）和绿色荧光（527nm，胞液）.•而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527nm）.•因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.5、Caspase-3活性的检测•Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。Westernblot分析caspase-3的活化Caspase3，6，7Caspase-3正常以酶原(32KD)活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。荧光分光光度计分析活化Caspase-3谢谢！