中药化学和天然药物化学实验讲稿.

1防己中生物碱的提取、分离与鉴定[适用对象]——药学、药剂、环境、中药、中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业[实验学时]——24一、实验目的学习生物碱类成分的一般提取分离法，通过实验要求：（1）掌握生物碱的溶剂提取法和粉防己碱与防己诺林碱的分离方法。（2）熟悉生物碱的一般理化性质。（3）熟悉粉防己碱和防己诺林碱的检识方法。（4）掌握回流法、萃取法、结晶法等的基本操作过程及注意事项。二、实验原理本实验是根据粉防己碱和防己诺林碱游离时难溶于水，易溶于氯仿，成盐后易溶于水，难溶于氯仿的性质提取得到总生物碱。再利用两者在冷苯中的溶解度不同，使之相互分离。三、仪器设备（单口，双口）圆底烧瓶，冷凝管，铁架台，分液漏斗，三角烧瓶，滤纸，微量抽滤器，布氏漏斗，层析槽，毛细管等。四、相关知识点防己为防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根。总生物碱含量约为1.5~2.3%，主要为粉防己碱和防己诺林碱。1、粉防己碱（tetrandrine），又称汉防己甲素，分子式C38H42N2O6，在防己中的含量约为1%，为无色针状结晶（乙醚），mp.217~218℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿，溶于乙醚、苯等有机溶剂，几乎不溶于水和石油醚。粉防己碱R=CH3防己诺林碱R=H2、防己诺林碱（fangchinoline），又称汉防己乙素，分子式C37H40N2O6，在NOMeORCH3H3CMeONOMeOO2防己中的含量约为0.5%，六面体粒状结晶（丙酮），mp.237~238℃。溶解度与粉防己碱相似，但因较粉防己碱多一个酚羟基，故极性较粉防己碱稍大，因此在冷苯中的溶解度小于粉防己碱，可利用此性质相互分离。五、实验步骤（一）总生物碱的提取称取粉防己粗粉150克，置1000ml圆底烧瓶中，加95%乙醇以浸透并盖没生药为度（约需400ml）。水浴加热回流1小时（加热期间振摇数次），滤出提取液，药渣再加95%乙醇以浸没为度（约需300ml），如上法再热提一次，滤出提取液，最后将瓶内药渣倒在布氏漏斗上抽滤压干，药渣弃去。合并两次乙醇提取液，放冷后如有絮状物析出，再抽滤一次，澄清液回收乙醇，浓缩至糖浆状无乙醇味为止，得乙醇总提取物。（二）生物碱的分离1、亲脂性生物碱和亲水性生物碱的分离糖浆状总提取物移至大三角烧瓶中，逐渐加入1%盐酸稀释，充分搅拌使生物碱溶解，不溶物呈树脂状析出，直至加酸水溶液不再发生混浊为止（约需300ml），静置，倾出上清液，瓶底的树脂状杂质以1%盐酸少量分次洗涤，直至洗液对生物碱沉淀试剂反应微弱时为止。合并洗液和滤液，静置片刻，抽滤得澄清滤液，置1000ml三角烧瓶中，滴加浓氨水至PH9左右，此时亲脂性叔胺碱游离析出（如有发热现象，设法冷却），待溶液冷后，移至1000ml的分液漏斗中，加氯仿150ml振摇萃取。分取氯仿层，氨碱性水溶液再以新鲜氯仿萃取数次，每次用氯仿100ml，直至氯仿抽提液的生物碱反应微弱时止（检查时取少量氯仿抽提液置表面皿上，待溶剂挥干，残留物中加稀盐酸数滴使溶解，再加生物碱沉淀试剂试之），合并氯仿液。此氯仿液中含亲脂性叔胺碱，氯仿萃取过的氨碱性水溶液含亲水性季铵碱。后者取出少量，加盐酸酸化至PH4~5，滴加雷氏铵盐饱和水溶液，观察有无沉淀出现。2、亲脂性碱中酚性和非酚性碱的分离氯仿萃取液合并约（300~400ml）移至1000ml的分液漏斗中，以2%氢氧化钠水溶液40ml一次，萃取2次，氯仿液再用水20ml一次，洗涤2次。分取氯仿层，加无水碳酸钾脱水干燥，过滤，滤液常压下回收氯仿。将氯仿全部蒸去，残留溶剂去瓶塞后挥干，得粗总非酚性生物碱。32%氢氧化钠提取液合并后取出少量，加盐酸酸化后进行生物碱反应。附注：防己诺林碱虽有酚羟基但不溶于氢氧化钠水溶液中，因而和非酚性生物碱一起在氯仿层中。3、叔胺生物碱的纯化在盛有非酚性生物碱的圆底烧瓶中，加丙酮加热溶解，过滤，用热丙酮洗涤滤纸，滤液、洗液合并，回收丙酮至适量，放冷，加塞静置待结晶析出。析出完全后抽滤收集。母液再浓缩重复收集，尚可得结晶。合并数次结晶即为粉防己碱和防己诺林碱的混合物。4、粉防己碱和防己诺林碱的分离苯冷浸法：取上述结晶状混合物碱称重，置于50ml三角瓶中，加5倍量的苯冷浸，时时振摇，冷浸半小时后，过滤分开苯溶液和苯不溶物。苯溶液回收苯至尽，残留物以丙酮重结晶，得细针状结晶，为粉防己碱。苯不溶物待挥发去残留的苯后，也用丙酮重结晶，可得粒状结晶，为防己诺林碱。（三）生物碱的一般鉴定方法1、沉淀反应（1）碘化汞钾试验：取样品的稀酸水溶液1ml，加碘化汞钾试剂（Mayer氏试剂）1~2滴，出现白色或类白色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。（2）碘化铋钾试验：取样品的稀酸水溶液1ml，加碘化铋钾试剂（Dragendorff氏试剂）1~2滴，出现棕黄至棕红色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。（3）碘—碘化钾试验：取样品的稀酸水溶液1ml，加碘—碘化钾试剂（Wangner氏试剂）1~2滴，生成褐色至暗褐色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。（4）雷氏铵盐试验：取样品的稀酸水溶液（PH4~5）1ml，加雷氏铵盐试剂数滴，生成黄红色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。（5）苦味酸试验：取样品的中性溶液1ml，加苦味酸的饱和水溶液1~2滴，生成黄色沉淀者为阳性反应，表示有生物碱存在。2、薄层色谱吸附剂：中性氧化铝（Ⅲ级）干法制版样品：（1）粉防己碱（2）防己诺林碱（3）总提取物（均以氯仿溶解）4展开剂：氯仿—丙酮—苯（3：1：4）显色剂：喷以改良碘化铋钾试剂（干法铺板显色时，要在溶剂未干前喷显色剂，否则氧化铝粉末易飞散，使薄层破坏）。（四）实验流程防己粗粉150g95％乙醇加热回流2次（第1次400ml，第2次300ml），每次1h，过滤滤液药渣（弃去）回收（沸石）乙醇至无醇味浓缩液（总生物碱）加l％盐酸300ml充分溶解，静置，抽滤酸水液不溶物置于分液漏斗中，加氨水调PH值9～10，氯仿振摇萃取碱水层氯仿层（雷氏铵盐试验）2%NaOH40ml萃取2次氯仿层碱水层40ml水分2次洗涤，无水（酚性碱）碳酸钾干燥后，滤过沉淀反应氯仿层回收氯仿防己总生物碱粗品加丙酮30ml，加热溶解，滤过丙酮溶液浓缩至适量，过夜析晶，抽滤防己总生物碱精制品5倍量冷苯浸0.5h后滤过，合并滤液苯溶液苯不溶物加丙酮加热溶解，趁热过滤加丙酮加热溶解，趁热过滤滤液滤液放置析晶，滤过，干燥放置析晶，滤过，干燥粉防己碱（针状结晶）防己诺林碱（粒状结晶）5六、实验报告要求应包括原理描述、实验流程、数据记录、解决问题的能力、实验结果、实验效果及建议等。七、思考题1、粉防己碱和防己诺林碱在结构与性质上有何异同点？实验过程中，应怎样利用它们的共性及个性进行提取分离？请设计方案。2、分离水溶性与脂溶性生物碱的常用方法有哪些？3、从防己中分离脂溶性、水溶性碱，酚性、非酚性碱的依据是什么？4、萃取过程中怎样防止和消除乳化？5、生物碱的沉淀反应应在什么条件下进行，为什么？八、实验成绩评定方法本门实验课程考核成绩占课程总成绩的30%，该实验考核成绩占实验总成绩的40%。考核分实验预习、实验过程操作、实验报告等三个方面，成绩计算为预习实验占20%（包括原理描述、实验流程）、实验过程操作占40%（包括数据记录、解决问题的能力）、实验报告占40%（包括实验结果、实验效果）。槐花中黄酮类化合物提取、分离和鉴定[适用对象]——药学、环境、中药专业[实验学时]——18一、实验目的要求学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求：（1）通过芸香苷提取与精制，掌握沸水提取黄酮类化合物的原理和操作。（2）掌握由芸香苷水解制取槲皮素的方法。（3）掌握黄酮苷和黄酮苷元的分离。（4）掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的检识方法。二、实验原理由槐花中提取芸香苷的方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制，或根据芸香苷分子中具有酚羟基，显弱酸性，能与碱成盐而增大溶解度，以碱水为溶剂煮沸提取，其提取液加酸酸化后则芸香苷游离析出。三、仪器设备6单口圆底烧瓶，冷凝管，铁架台，烧杯，电炉，烘箱，水浴锅，三角烧瓶，滤纸，微量抽滤器，布氏漏斗，试管，层析槽，石棉网，毛细管等。四、相关知识点槐花为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达12~20%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。芸香苷（rutoside），分子式C27H30O16，分子量610.51，淡黄色针状结晶，mp.177~178℃。难溶于冷水（1：8000），略溶于热水（1：200），溶于热甲醇（1：7），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：30），冷乙醇（1：650），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中。槲皮素（quercetin），分子式C15H10O7，分子量302.23，黄色针状结晶，mp.314℃（分解）。溶于热乙醇（1：23），冷乙醇（1：300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水。OORHOOHOHOHO芸香苷R=—葡萄糖—鼠李糖槲皮素R=H五、实验步骤（一）芸香苷的提取（水提取法）称取槐花米50克，置1000ml烧杯中，加沸水800ml，加热保持微沸1小时趁热用棉花过滤，滤渣再加600ml水煮沸1小时，趁热过滤，合并2次滤液放置过夜，析出大量淡黄色沉淀，抽滤，沉淀用水洗3~4次，抽干置于空气中干燥即得粗芸香苷，称重计算得率。（二）芸香苷的水解称取芸香苷粗品2克，尽量研细，投入500ml圆底烧瓶中，加2%H2SO4溶液150ml，接上冷凝管，直火加热煮沸1.5小时，滤取沉淀物（即苷元槲皮素），滤液保留以鉴定糖部分，槲皮素沉淀经水洗涤抽干，自然干燥，称重并计算水解得率。（三）芸香苷、槲皮素重结晶称取芸香苷粗品2克，加甲醇50ml，加热溶解，趁热过滤，滤液浓缩一半，7放置析晶，过滤。滤液适当浓缩后放置，复析出结晶，滤取结晶。必要时结晶再用甲醇重结晶一次。取槲皮素全部，加适量95%乙醇，同上法重结晶一次。（四）芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱鉴定1、点样：取新华一号色谱滤纸，规格20cm×20cm，在滤纸下端约2cm处用铅笔画一直线，间隔2cm分别点上下列样品或标准溶液：（1）糖样品溶液（2）标准葡萄糖溶液（3）标准鼠李糖溶液（4）芸香苷样品甲醇溶液（5）芸香苷标准品溶液（6）槲皮素样品甲醇溶液（7）槲皮素标准品溶液2、展开剂：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上层上行展开。3、显色：展开完毕，将滤纸取出，记录溶剂前沿位置。待溶剂挥尽后，在（3）与（4）点之间剪开，分别显色。（1）糖的显色：喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，在105℃烘10分钟，显棕色斑点。计算并比较样品和标准品的Rf值。（2）黄酮化合物的显色：①可见光下观察色斑，紫外灯下观察荧光斑点。②经氨气熏后再观察。③待氨气挥尽后，喷1%AlCl3甲醇溶液，再观察。④计算并比较样品与标准品的Rf值。（五）芸香苷和槲皮素性质试验1、酸性试验：取小试管8支，每4支一组，第一组每管中加入芸香苷1mg，第二组每管中加入槲皮素1mg，每组四管中分别加入稀氨水、5%碳酸氢钠水溶液、5%碳酸钠水溶液、1%氢氧化钠水溶液各2ml，振摇后观察各管溶解情况。溶解的溶液应呈黄色。再加浓盐酸数滴酸化，黄色褪去或变浅，并有沉淀析出或产生浑浊。2、Molish反应：取试样1mg置小试管中，加乙醇0.5ml溶解，加α-萘酚试剂1~2滴，摇匀。倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约0.5ml静置。观察两层溶液的界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖的结构（糖和苷类均呈阳性反应），比较芸香苷和槲皮素的不同。3、Fehling试验：取试样数mg，溶于0.5ml热水中，加斐林氏试剂甲、乙等量8混合液2ml，沸水浴上加热，如产生氧化亚铜的暗红色或黄色沉淀表示有还原糖或其它还原性物质。充分加热作用后滤去沉淀，滤液滴加浓盐酸酸化，在水浴上加热水解，