中药注射剂色谱指纹图谱试验研究操作规程指引(修订稿)

中药注射剂色谱指纹图谱试验研究操作规程指引（修改稿）供讨论用说明：本操作规程为规范中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而订，规定未能概括的内容，可自行补充调整，但申报资料中须有相应的说明和申述。操作规程中的“色谱指纹图谱”包括柱色谱及平面色谱（薄层色谱），后者指色谱的彩色图像及扫描轮廓图。光谱指纹图谱及脱氧核糖核酸指纹图谱另有规定。一、样品收集样品收集是试验研究指纹图谱的最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，所以要收集有代表性的样品。收集不少于10批样品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。（一）原料药材：在缺乏科学依据说明药材的化学成分与中医临床疗效的之间关联的情况下，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，所以在指纹图谱的宏观特征一致的条件下，药材样品个体的差异是正常的，因此须反映指纹图谱的真实性，以此作为选择原药材投料或混批提取的重要依据。药材的“批”不是工业生产的“批”，是指相互独立的样品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干份样品，以保证试验结果的代表性。由于收集药材样品受主观和客观的条件限制，供试验的样品严格讲均没有统计学的意义，所以样品数越多越好，10批是最低的要求。样品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：药材名称样品来源（真实记录样品是来自何处：传统产地采集或是资源丰富的产地采集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等）。采集时间（购买时间）及采集人货源情况调查（货源是否充足、是否稳定、产地近三年的情况）基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地采集的药材品中结合植物形态鉴定品种。如缺原植物，只能由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。如近缘品种难以区分的野生品种（如白花蛇舌草），应在其后的指纹图谱研究中仔细比较，如获得的指纹图谱相似度很高，也可应用，但须明确记录。并在今后实施GAP时确定一个品种，如指纹图谱相似度很低，则须确定品种，改为栽培品使用。商品混乱的品种（如陈皮）产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方量大的药材必需首先注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。质量评估：为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的判断误差，首先药材需符合药典或部颁标准规定，按标准进行全检，并详细记录。必要时可增加相应的理化鉴别或含量测定。所有药品均须编号，并附药材外形照片。供试样品的留样、贮藏和标签：由于指纹图谱研究周期较长，供试样品必须在干燥、低温、避光处贮藏，标签必须有编号，采集样品的编号应与贮藏样品、试验样品的编号一致。留样数量应不少于试验实际用量的3倍。以保证试验结果有异议时的可追踪性。如以中药饮片或炮制品为起始原料，应采用符合规范的样品。申报资料可将关键内容扼要填写于表一中：表一药材名称样品编号样品来源采集时间（购买时间）及采集人货源情况调查基原鉴定及鉴定人学名：鉴定人：质量评估供试品留样数量：容器：贮藏地点及条件样品标签原始记录保存处附：1，药材外形照片2，药材的色谱图（试验完毕后）：（二）提取物：药材所含成分的个体差异可以通过规范的生产工艺，中药注射剂新药研制的品种，必要时可逐步采用药材混批调整使内在质量尽可能一致，再进行其后的制剂工艺，以保证提取物和制剂质量的可控。关键技术及相应参数填写于表二，并附指纹图谱（试验完毕后）。表二提取物名称批号日期提取方法（关键技术）混批后批号混批比例原始记录保存处供试品留样数量：容器：贮藏地点及条件附：混批前後的指纹图谱。（三）制剂（注射剂）：产品批号、生产单位、注射剂批号与提取物批号的相关性均须有明确的记录，以保证试验数据的可追踪性。产品的“对照指纹图谱”是建立在10批以上的产品指纹图谱的基础上，应任选一批较有代表性的色谱作为“对照指纹图谱”。各批供试样品须有留样。主要内容填写于表三，并附指纹图谱（试验完毕后）。表三：样品批号生产单位供试品数量供试品留样数量：容器：贮藏地点及条件：二、供试品溶液的制备（一）药材供试品溶液的制备取样：供试品取样应注意代表性，以保持实验室取样与实际生产应用药材一致，例如地上部分的药材，取样约0.5~1Kg，分别称量茎、叶、花、果的大致比例并做记录。如果实类药材，生产时去除种子的，供试品也应除去种子，并做记录。如药材表观质量不均匀（如大小不一、肥瘦不等、粗细不匀等），应注意供试品的取样有代表性，其后的试验中，必要时应做比较试验，以考察所含成分有无显著差异，供生产参考。称样：应按照常规要求，将选取的样品适当粉碎后混合均匀，再从中称取试验所需的数量，一般称取供试品与选取样品的比例为1：10，即如称取1g供试品，应在混合均匀的10g选取的样品中称取。因为指纹图谱需要提供量化的信息，称取供试品的精度一般要求取3位有效数字。制备：药材指纹图谱的主要目的，一是考察药材本身的质量情况，二是以药材的指纹图谱为参比，提取物及制剂的指纹图谱与之比较，以考察制剂与原药材的相关性。药材供试品溶液的制备，可选用适宜的溶剂和提取方法，尽量使药材中的成分较多的在色谱图中反映出来，并达到较好的分离。最终制备的供试品溶液还应能适应色谱试验的需要，如液相色谱的供试品溶液宜用色谱流动相或色谱洗脱强度较弱的溶剂；薄层色谱用的供试品溶液可采用液液萃取或固液萃取，选用适宜的溶剂制备供试品溶液。气相色谱的供试品可采用水蒸气蒸馏法、顶空进样法或固相微萃取法，供试品如需使用溶剂，应用低极性低沸点的溶剂。定容：供试品溶液最终应用适宜的溶剂于标定容量的容器，制成标示浓度的供试品溶液（g/ml或mg/ml）。放置：一般要求供试品溶液尽量新鲜配制，如连续试验需要，供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下短期放置，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。标签：须注明编号或批号，应与取样的药材编号一致，或有明确的关联，以保证数据的可追踪性。主要操作过程及数据应详细记录。（二）提取物供试品溶液的制备称取不同批次的提取物，参照“供试品溶液”的制备方法制备成一定量的溶液，备用。标签须注明编号或批号，应与取样的药材编号一致，或有明确的关联，以保证数据的可追踪性。主要操作过程及数据应详细记录。（三）注射剂供试品溶液制备液体注射剂可直接或稀释作为供试品溶液，如需要可用适宜的溶剂提取并制备成一定量的溶液。固体形式的注射剂（冻干粉针）须注意注射剂成品的附加剂有无对色谱试验干扰。如有干扰，须研究采取适宜的样品预处理方法以排除干扰（如含有氯化钠则液相色谱不可使用蒸发光散射检测器；如糖分太多，可能影响薄层色谱的清晰度和分离度；冻干粉针的成型剂用量较大时也可能影响色谱的质量，等）。此外，单方注射液药材或复方注射剂中不同药材成分类别如果相差较大，色谱条件要求不同，需要进行样品的预处理时，应分别进行试验，便于制备2个以上的指纹图谱。主要步骤及数据应详细记录。三、参照物（一）参照物的选择：指纹图谱的参照物质一般选取容易获取的一个以上注射剂中的主要活性成分或指标成分，主要用于考察指纹图谱的稳定程度和重现性，并有助于色谱的辨认。在与临床药效未能取得确切关联的情形下，参照物（复方注射剂应首选君药的活性成分或指标成分）可以表观地认为是指纹图谱的主要特征。指纹图谱参照物的作用不等同于含量测定的对照品。指纹图谱一般色谱比较复杂，内标物不易选择，也不易插入，指纹图谱不是含量测定，故内标物的作用也不等同于含量测定的内标物，因此应慎重考虑选用内标物质的必要性和可能性。参照物应说明名称、来源和纯度。如无参照物可提供制备参照物溶液，也可选指纹图谱中的适当的色谱峰做为参照峰，说明其色谱行为和有关数据，并应尽可能阐明其化学结构及化学名称。（二）参照物溶液的制备：精密称取样品，用适宜的溶剂制成标示浓度的溶液，备用。四、实验常用的色谱技术有薄层色谱、液相色谱、气相色谱及其他色谱技术。须注意各种色谱技术的特点和不足，结合实际选用。不论何种色谱技术，选用的原则是良好的专属性、重现性和可行性。专属性：建立的指纹图谱必需能够表达该品种的唯一特点，即唯一性。重现性：同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹的各特征峰（斑点）作为整体（峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例）在不同实验室和不同操作者之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度，以表明方法的可行性。同一品种不同样品之间的相似度不属于此范围。可行性：色谱方法和试验条件应易于推广和便于执行，即一旦由药品监督管理部门批准成为质量标准的内容后，生产厂家、中等水平的分析实验室和省级以上的法定检验机构均可执行该标准。（一）实验室*承担色谱指纹图谱的实验室应符合以下6个原则：1，实验室具备承担指纹图谱的总体能力；2，实验室设备通过检验证明符合指纹图谱试验研究的需要；3，技术人员具备从事指纹图谱试验研究的能力；4，对实验室的技术能力评价应有定期的内部的独立检查；5，试验数据有可追踪性，与其他实验室有可比性；6，实验室应有质量保证体系，以确保各种措施实施的透明和一致。（二）仪器：所用的仪器性能应能满足指纹图谱试验的需要，并须经校验；如果同一台仪器有两个以上的项目共用，须有特别措施保证仪器的清洗和维护，仪器使用要有明确记录。液相色谱柱记录商品名称、生产厂家及相关参数（固定相、柱长度、内径、填料粒度等）；一般需用三根以上不同生产厂家的柱子进行比较，经比较试验后应固定色谱柱来源与规格。色谱系统的适应性试验可用该品种指纹图谱所用的参照物，参照常法进行，如柱效明显降低，在排除其它因素后，说明该色谱柱不能继续使用。另一方法是用制作“标准指纹图谱”的提取物留样样品定期重复试验，将前后得到的指纹图谱垂直叠加，直观比较，各指纹特征峰是否能重合及整个色谱的形状是否有变异，如有变异致使指纹特征已难以辨认，在排除其他可能的影响因素后，可认作该色谱柱不能使用。仪器使用人、使用时间及周期应有记录。薄层色谱系离线操作，薄层板为一次性器材，不存在重复使用问题，但不同厂家的商品预制薄层板质量可能不一致，手工自制的薄层板只能供筛选试验条件使用，用确定的条件制作指纹图谱（图像）时必须用质量保证的商品预制薄层板（如Silicagel60，Merck等）。图谱摄像时如用数码摄像机，解像度应在20,00,000象素以上，荧光色谱须在薄层色谱专用的紫外光灯箱下加滤光片拍摄。如有相应的积分软件，可立即生成轮廓扫描图以及积分数据；也可用常规的薄层色谱扫描仪进行积分和绘制轮廓图谱。薄层扫描仪的机械部分、电子部分及光源须定期校验。气相色谱如色谱柱类型、长度、内径、老化条件、载气、流速、柱温、柱头压力、进样方式、进样口温度、检测器等均需考察；仪器除定期检查校验外，填充柱或毛细管柱的柱效也应参照液相色谱柱定期校验柱效。其他种类的色谱仪参照上述原则校验和记录。*参阅EURACHEM/CITAC“QualityAssuranceforResearchandDevelopmentandNon-routineAnalysis”EnglishEd.1998各种仪器均须按照仪器操作手册以及SOP进行。（三）试验方法和试验条件：色谱指纹图谱试验方法和试验条件的优选：试验条件应能满足指纹图谱的需要，一般情况下，供含量测定用的试验条件虽然文献报道较多，但一般不能满足指纹图谱的需要，故需进行试验条件的优选。试验方法和试验条件选择的目的是通过比较实验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。方法和条件须经过严格的方法学验证。由于色谱指纹图谱具有量化的概念，所以从样品的称取、供试液的制备和进行色谱分析时均须定量操作。在指纹图谱研究中，“量化”的含义是指在定量操作的条件下所得到的指纹图谱在整体特征上可以作半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量”方面个体样品之间的总体差异程度，以及提取物和制剂的相似程度。选择试验条件须进行方法学比较。如：液相色谱的色谱柱需做比较试验加以选择，流动相至少用三