丹皮酚微乳的制备及经皮吸收研究

丹皮酚微乳的制备及经皮吸收研究韩盈，刘继勇，李凤前，彭程，孙华君，胡晋红*（第二军医大学长海医院药学部，上海200433）摘要：选择适宜比例的油相、表面活性剂、助表面活性剂、水相制备丹皮酚微乳制剂以增加药物溶解度和经皮渗透量，优化处方，并对其理化性质进行研究。通过绘制伪三元相图研究形成O/W微乳的区域和能力；以单位面积累积渗透量为指标，优化处方；并考察了制剂的外观、形态、粒径分布等理化性质。处方选用肉豆蔻酸异丙酯（IPM）为油相，lecithin为表面活性剂，聚氧乙烯辛基苯基醚（OP）为助表面活性剂；微乳中Lecithin与OP比例为3∶7时，O/W微乳区最大，确定了5个处方。通过处方筛选确定了最佳处方，制备出澄清透明、平均粒径为（58.2±5.0）nm的丹皮酚微乳制剂。关键词：丹皮酚；微乳；伪三元相图；经皮给药；体外评价PreparationandinvitrotransdermalpermeationofpaeonolmicroemulsionHan-Ying，LIUJi-Yong，LiFeng-Qian，Peng-Cheng，SUNHua-jun，HUJin-Hong*(DepartmentofPharmacy，ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433，China)Abstract:Topreparethemicroemulsionofpaeonolinordertoincreasesolubilityanditsinvitrotransdermaldeliverybyusingappropriateproportionofoil，surfactant(S)，cosurfactant(CoS)andwater．Theformulationofproportionwasoptimized．Thephysicochemicalpropertiesofthemicroemulsionwasstudied.Pseudo—tertiaryphasediagramswerepreparedtoobtaintheareaandabilityofO/Wmicroemulsionformation.Usinginvitrocumulativeamountpermeatedasindex,optimizetheformulationofmicroemulsion.Thephysicochemicalpropertiesincludingappearance,particlesizedistributionandshapewereexamined.IPMwasselectedasoil,lecithinandOPwereusedassurfactantandcosurfactant,repectively.Inmicroemulsion,whentheratiooflecithinandOPwas3:7,theareaofO/Wmicroemulsionwaslargest,meanwhileobtain5formulations.Throughthescreeningofformulations,theoptimizedformulationwasobtained.Preparetheclearpaeonolmicroemulsion,theaparticlesizedistributionwas（58.2±5.0）nm.Keywords:paeonol;microemulsion;Pseudo—tertiaryphasediagrams;transdermaldeliverysystem;invitroevaluation微乳（microemulsion，ME）作为一种新型经皮给药的载体，是由水相、油相、表作者简介：韩盈（1983-），女，汉族，硕士研究生。E-mail:[e-mail]。*通讯作者：Tel:[phone]，Fax:[phone]，E-mail:[e-mail]。面活性剂和助表面活性剂在适当的比例自发形成的一种透明或者半透明的各向同性的且热力学稳定的体系，其粒径一般为10～100nm。微乳作为经皮给药载体，具有增加亲脂性或亲水性药物的溶解度、提高药物的透皮速率、维持恒定的有效血药浓度等优点。丹皮酚(Paeonol,Pae)又称牡丹酚，是毛茛科植物牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）根皮和萝摩科植物徐长卿PycnostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schu全草的主要活性成分，具有镇静、催眠、解热、镇痛、抗炎、抗过敏、抗菌等多种药理活性。上市的剂型主要是丹皮酚注射剂，丹皮酚片以及丹皮酚软膏。临床上用于治疗风湿痛、胃痛和其他疼痛、湿疹、过敏性皮炎等，具有较好疗效。丹皮酚用于经皮给药，克服了治疗湿疹、过敏性皮炎等传统激素类药物副作用大的缺点，而且它作为中药单体具有毒副作用低等优越性。为了克服丹皮酚水溶性差、熔点低、易挥发、稳定性差等缺陷，本研究尝试将其载入新型的透皮给药载体—微乳，选择具有低毒、低刺激性的油相、表面活性剂、助表面活性剂来制备丹皮酚微乳，绘制了伪三元相图确定了最优处方，并进行了体外评价。材料与方法仪器LC-10ADVP型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；透皮扩散仪（自制，长海医院药学部）；ZetasizerNanoZS90测定仪（英国马尔文公司）；HITACHIH-600透射电子显微镜（日本日立公司）。药品丹皮酚原料药（上海青浦凤凰精细化工有限公司，批号071201，纯度≥98%）；丹皮酚标准品（中国药品生物制品检验所，批号110708-200506，纯度≥98%）；LecithinE200（德国Degussa公司）；肉豆蔻酸异丙酯(IPM，国药集团化学试剂有限公司)；聚氧乙烯辛基苯基醚（OP，上海凌峰化学试剂公司）；实验动物昆明种小鼠，♂，体重20±2g，第二军医大学动物中心提供,动物合格证号：2002-0026药物测定方法用HPLC法测定药物含量。色谱柱KromasilC18柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相甲醇：水（70∶30），流速1.0mL/min，检测波长273nm，进样量20μL。标准曲线为A=43978C+13558，r=0.9999，（n=6），线性范围：2~67μg•mL-1，日内日间精密度均小于2%，平均回收率为98.81%，符合方法学要求。伪三元相图的绘制及含药微乳的制备采用水滴加法结合origin6.1软件绘图的方法进行伪三元相图的绘制。将lecithin与OP按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的质量比混合，总质量为0.5g。加入IPM0.45g于表面活性剂的混合物中，37℃恒温水浴下，磁力搅拌混匀。逐滴滴加纯净水，同时记录加入水的量与系统呈现的现象，并计算每一组分在体系中的质量比，根据体系的成乳情况确定可成微乳的lecithin/OP比值（Km）。取可成乳的Km值比例的表面活性剂混合物（lecithin与OP的混合物），将混合物与油相（IPM）分别按质量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合，37℃水浴条件下逐滴滴加纯净水，记录加入水的量与系统呈现的现象，滴加过程中体系外观澄明、流动性好、离心稳定（13000r•min-1，30min）则判断形成微乳，计算每一组分在体系中的质量比，以混合表面活性剂、水和油作为三元相图的顶点origin6.1绘制伪三元相图，微乳的鉴别方法采用染色法。在伪三元相图的O/W区域中，选择适当比例的各相，将0.5%丹皮酚加入油相、表面活性剂、助表面活性剂的混合物中，充分溶解，然后逐渐加入水，不断搅拌，平衡后制得丹皮酚微乳。体外经皮渗透实验取昆明种雄性小鼠20±2g，腹部脱毛，静养24h，剥离腹部皮肤，刮去皮下脂肪和组织，用蒸馏水和生理盐水冲洗干净，置于生理盐水中于4℃保存待用。采用Franz扩散池在37±1℃下进行，皮肤固定在供给室和接收室之间，皮肤表皮层面向供给室，扩散池的有效渗透面积A为0.85cm2，接收液为0.9%的生理盐水，接收室体积为5mL。将待考察的透皮给药体系1mL缓慢加人到供给池中，开启电磁搅拌器，于0.5，1，2，4，6，8，10，12，16，24，36h取接收液5mL（每次取样后均补加等量的0.9%生理盐水），离心机10000r/min离心10分钟，HPLC测定丹皮酚浓度。丹皮酚离体鼠皮经皮渗透实验的单位面积累积透皮流量的计算公式：Qn=CnVn+∑CiVi/A。公式中Cn为取样时药物在接受液中的浓度，Ci是药物在受试样品中的浓度，Vn和Vi分别是接受池的体积（5mL）和样品体积（1mL）。A是扩散池的扩散面积（A=0.85cm2）。以Qn对t做曲线，并对曲线中的直线部分进行回归，求出直线斜率dQ／dt，即稳态渗透速率Js(μg•cm-1•h-1)。最佳处方筛选在Lecithin与OP比例为3:：7的相图中选择各成分质量比不同的五个点制备为含丹皮酚0.5%的微乳给药体系，按体外经皮渗透实验方法进行透皮能力考察，以单位面积累积渗透量为指标，确定最佳处方。微乳理化性质的研究粒径及其分布取最佳处方制备的微乳3mL至测量杯中，选用633nm激光光源，测试温度为室温，经样品散射后的光在90°范围内变化不同的角度检测，统计分析微乳的粒径大小及其分布范围。用英国Marvin公司型号为ZetasizerNanoZS90动态激光散射粒径测定仪测定丹皮酚微乳的粒径大小。透射电镜形态观察丹皮酚微乳点样于蜡片，将喷碳铜网放于试液上(膜面向上)，l～2min后取出铜网，用滤纸小片从制网边缘吸干多余液体，再浸于2%磷钨酸中负染5-10min，再用滤纸小片从铜网边缘吸干多余染液，将此铜网置透射电子显做镜下观察形态并拍照。结果1.伪三元相图的绘制图1为表面活性剂和助表面活性剂不同比例的伪三元相图，从图中可知，当Lecithin与OP比例为3∶7、4∶6、5∶5时，可成乳，其中以比例为3∶7时有最大的成乳面积，故选择乳化剂（Lecithin）与助乳化剂（op）比例为3∶7。abcFigure1Pseudo—tertiaryphasediagramcomposedofIPM，lecithin一OPmixture(Smix，a：S／CoS=5∶5；b：S／CoS=4∶6；c：S／CoS=3∶7)anddistilledwater．Oneaxisrepresentingwater，onerepresentingoilandthethirdrepresentingtheSmix．Theconcentrationofeachcomponentisexpressedinpercentageofweightpercent(w／w)．TheshadedregionrepresentstheareaofO／Wmicroemulsionexistence2.最佳处方筛选Table1.theformulationdesignedforscreeningformulationandtheresultsofcumulativeamountpermeatedVehicleIPM（%）Smix（%）Water（%）Qn（μg•cm-2）MF1132067869.6±29.7MF21225631686.1±74.9MF3123158398.4±6.95MF4925661859.74±11.8MF5152560582.4±4.3根据不同处方含药微乳的体外透皮实验数据显示，处方4具有明显的优势，单位面积累积透皮量为1859.74±11.8μg•cm-2，与其他四个处方相比优势显著，故选择处方4作为最佳处方。3.微乳的理化性质粒径分布：丹皮酚微乳的平均粒径为（58.2±5.