乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究

乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究王雷高文信陈英新【摘要】目的探讨乳铁蛋白（lactoferrin)对舌癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达调控的情况。方法采用四甲基氮唑蓝实猃（MTT)、RT-PCR法检测乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖作用及VEGFmRNA表达改变的情况。结果乳铁蛋白显著抑制Tca8113细胞的增殖，呈剂量依賴性，乳铁蛋白对Tca8113细胞VEGF的RT-PCR产物试验组(2和3)与对照组之间比较，差异具有统计学意义（尸0.05)。结论乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖有抑制作用，可以降低细胞中VECFmRNA的表达水平，为乳铁蛋白用于肿瘤的預防及治疗提供实验基础。【关键词】乳铁蛋白血管内皮生长因子口腔肿瘤InhibitoryeffectoflactoferrinonvascularendothelialgrowthfactorexpressionInTca8113cellWANGLeitGAOWenxintCHENYingxiruCollegeofStomatology,JilinUniversitytChangchun130041【Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectoflactoferrinonvascularendothelialgrowthfactorexpression.MethodsMTTassaywasusedtoevaluatethegrowtheffectoflactoferrinonTca8113cells.Atthesametime,thegeneexpressionofVECFwasexaminedbyRT-PCR.ResultsLactofenincouldsignificantlyinhibitetheproliferationofTca8113cellsinadosedependentmanner.TheexpressionofVEGFgeneinTca8113cellsdecreasedsignificantlywhencomparedwiththecontrolgroup(P0.05).ConclusionLactoferrincannotonlyinhibitTca8113cellgrowth,butalsodown-regulatetheexpressionofVECFinTca8113cell.【Keywords】LactoferrinVascularendothelialgrowthfactorOralcancer中图分类号：R739.8文献标识码:A乳铁蛋白（lactoferrin,LF)亦称乳转铁蛋白(lactotransferrin),存在于多种组织中，具有多种多样的生物学功能。在各种体液或分泌物中以乳汁特別是初乳中乳铁蛋白含量最高，在哺乳动物的很多外分泌物中，如眼泪、唾液和精液等也存在较低浓度的乳铁蛋白。乳铁蛋白具有广谱抗菌作用、抗病毒作用、抗氧化作用、抗癌作用、可以调节机体免疫反应。研究证明乳铁蛋白对癌细胞有明显的抑制作用，乳铁蛋白对消化道肿瘤，如结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌，具有化学预防作用，并可抑制由此引发的肿瘤转移。我们探讨乳铁蛋白对舌癌Tca8ll3细胞的生长抑制作用,及其对肿瘤细胞血管生成的影响。资料和方法I主要试剂与来源：重组人乳铁蛋白(recombinanthumanlactoferrin〉购于SIGMA公司，基金项目:国家十五科技攻关资助项目（2004BA720A28）；杏林省科技发展计划项目（20010591-2)作者单位:130041长春，杏林大学口腔医学院通讯作名:高文信E-mail:wlandni®yahoo.com.cn溶于PBS中，储存浓度5mg/ml，-20℃储存备用。噻唑蓝（MTT)购自SIGMA公司。细胞培养基DMEM购于GIBIC0公司。2.细胞培养:Tca8113口腔舌癌细胞系购于上海细胞研究所，用10%胎牛血清的DMEM培养基,5%CO2,37℃培养、传代。3.MTT法检测细胞增殖：Tca8113细胞接种于96孔细胞培养板,细胞数5X104/孔,用不同浓度的乳铁蛋白（1.5、3、6、12、25、50μg/ml)处理Tca8113细胞24小时，每组细胞设3个平行孔，阴性对照组培养瓶中加入DMSO,空白对照组不加乳铁蛋白和DMS0。加入MTT,继续培养4h，A570mn测定吸光度,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。4.细胞形态变化正常细胞，鳞癌细胞经各浓度的乳铁蛋白处理24小时后PBS漂洗，倾去上层悬浮死细胞后加入新鲜培养基。另备一瓶细胞未用任何药物处理，将其用做对照细胞。将培养瓶置于CK倒置显微镜下，观察乳铁蛋白干预前后鳞癌细胞的不同形态。5•RT-PCR检测Tca8113细胞VEGFmRNA表达：VEGF上游引物：5、-ACATCTTCCAGGAGT-ACCCTGATGAG-3下游引物：5'-GCATTCACA-TTTGTTGTGGTGT–3’；β-actin的上游引物：5’ACACTGTGCCCATCTACG–3‘下游引物:5’GTCG-TCATACTCCTGCTTG3、Tca8113细胞接种于24孔细胞培养板,细胞奴2X10s/孔，用不同浓度的乳铁蛋白（12、6、3μg/ml)处理Tca8113细胞24小时，每组细胞设3个平行孔，培养板内细狍采用Trizols提取总RNA(promega,按说明书操作），用于RT-PCR检测VEGFmRNA的表达。采用二步法RT-PCR,细胞分试验组和对照组.1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物.图像分析仪（smartview)分析条带，用目的基因条带与β-actin基因条带的密度比值汁算表达强度。5.统计学处理:采用T检验作为显著性检验分析。结果1.乳铁蛋白对Tca8113细胞增殖的抑制作用:采用MTT法检测不同剂量重组人乳铁蛋白对Tca8113细胞的抑钊效应，结果显示加入1.5、3、6、12、25、50μg/ml重组人乳铁蛋白处理组的抑制率分别为16%、28%、30%、36%、43%、56%，其中加人3、6、12、25、50μg/ml乳铁蛋白组与单纯细胞培养组比较差异有著性（P0.05),且随乳铁蛋白浓度增加，抑制作用逐渐增强。2.细胞形态学观察:镜下可见鱗癌细胞胞质丰富呈多角形。癌细胞密集成片生长，嵌合如铺路石。乳铁蛋白干预后细胞正常形态发生明显的改变，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长.随乳铁蛋白浓度增加，细胞的粘附力降低，失去贴壁性，伪足消失，细胞变圆，生长缓慢.分裂相减少或消失，胞质粗糙，内有颗粒堆积,并可见细胞明显固缩，形态完整性遭到破坏（图1、2)。3.RT-PCR检测结果:逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)的结果表明重组人乳铁蛋白可以调节舌癌细胞的VEGFmRNA表达，并呈剂量依赖性(图3),乳铁蛋白浓度增加，VECF表达减少（图4)c实验组2和3与对照组间比较，P0.05,差异有统计学意义。讨论在抑制肿瘤发生、发展方面，用自然存在的复合物例如乳铁蛋白作为化学预防和化学疗法的方法已逐渐成为m要的治疗战略。乳铁蛋甶诱导细胞生长抑制的分子机制还不是十分淸楚。在口晬肿瘤中.为了更好的研究乳铁蛋白介导的抗肿瘤活性的可能机制.我们观察了乳铁蛋白对舌癌细胞VEGFmRNA表达的调控作用。肿瘤的形成及发展大体可分为两个阶段，即肿瘤细胞的克隆性增殖阶段及继之的血管形成支持肿瘤持续生长阶段。目前研究已证明肿瘤的生长依赖于血管生成，血管内皮细胞生长因子（VEGF)是诚为重要的血管形成因子,作用于血伢内皮细胞，可促使其分裂、增殖，具有丝裂原活性，并能诱发血管形成，在肿瘤的发生中起着重要作用。我们先前的研究也证明在口腔鳞状细胞癌中有VEGF的高表达。乳铁蛋ft的抗肿痫仉制是由多种机制介导的,F3前研究认为乳铁蛋白可以抑制血管的发生,Shimanuira^等研究牛乳铁蛋白对肿瘤诱发血管生成的影响以及对上皮细胞功能和血管生成相关细胞因子产生的影响。研究证明牛乳铁蛋白作为血管生成调节剂参与血管发生，通过阻碍内皮的功能及诱导IL-18的生成来完成。Norrby等的研究也认为乳铁蛋白可以抑制肿瘤的血管发生，乳铁蛋白在体外具有抗上皮细胞增殖的活性并且可以强烈抑制血管内皮生长因子介导的血管发生。Shimamura等研究证明，牛乳铁蛋白可以抑制血管生成因子介导的血管发生的一些过程。所有研究均进一步说明，乳铁蛋白可以通过抑制血管发生使其具有抗肿瘤活性。体外研究中，乳铁蛋白是否具有调节细胞生长的功能不同学者持有不同的观点。但是近几年的研究发现，人乳铁蛋白可以抑制头颈部鱗状细胞癌，是通过直接的细胞毒作用以及系统性的免疫调节作用来实现的。Xiao等的研究也证明乳铁蛋白体外抑制三种不同的头颈部细胞的增殖。Mckeown研究认为乳铁蛋白对口腔鳞癌的作用是变化的，12.5μg/ml乳铁蛋白作用鳞癌细胞48小时可以引起细胞增殖，但72小时是引起细胞死亡。大剂量(250,100,50μg/ml乳铁蛋白72小时均可以诱导细胞死亡。乳铁蛋白的抗肿瘤机制是由多种机制介导的.目前研究认为乳铁蛋白可以抑制血管的发生。我们实验中,首先论证了乳铁蛋白对舌癌细胞具有直接的细胞毒作用，可以明显抑制Tca8113细胞的生长，然后采用RT-PCR技术，从RNA水平检测了乳铁蛋白作用前后Tca8113细胞VEGFmRNA的基因表达改变情况。结果表明，乳铁蛋白作用于Tca8113细胞，可以引起舌癌细胞VEGFmRNA表达的减少，并且呈剂最依赖性，从而达到抑制肿瘤生长的目的。因此，重组人乳铁蛋白对肿瘤细胞VEGF的表达有一定的调控作用，在肿瘤治疗方面，乳铁蛋白的开发和利用具有一定的应用前景。参考文献1KciichiSZ.Lactofcrrin：AManrcriorsProteininMilk?AnimSci,2000.71(4)：329-347.2MasonDY,TaylorCR.Distributionoftransfcnin,ferritin,andlactofcrrininhumintissues.JClinPathol,1978.31：316-327.3凌啻萍.乳铁蛋臼的最新研究进展.食品科学.2003,24(1〉：160-163.4王宙，陈位新,高文倍.血符内皮细胞生长闪子、碱性成纤维细胞生长因子在U腔鲭状钿胞癌中的表达研究.现代U腔医学杂志，2004,18(4)：299-301.5ShimamuraM,YamamotoY,AshinoH,cta].Bovinelactofcnininhibitstumor-inducedangiogen^iK.IniJC*nc«r,2004,111(1)：111-116.6NorrbyK,Mattsby-Baltr^rI,InnocenliM,etal.OrallyadministeredborinelartoferrinRystemicallyinhibiuVF.CF(165)-mediatedangiogenesisintherat.IntJCancer,2CX)1,91：236-240.7WolfJS,LtC,VaradhacharyA,etal.OrallactoferrinresultsinTcell-dependenttumorinhibitionofhcaJandnecksquamouscdlcarcinomainvivo.ClinCancerRes,2007,13(5)：1601-1610.8XiaoY,MonittoCL,MinhasKM,ctal.Lactofem'ndown-regulatesClcyclinedependantkinasesduringgrowtharmtofHeadamineckcancerc«Ug.clincancerRes,20〇4,10：868386S6.9MckcownS,Lund