08化妆品的微生物学检查

1第八章化妆品的微生物学检查2化妆品的卫生标准化妆品微生物学检查基础知识化妆品中微生物总数检查化妆品中控制菌检查3一、2007版“化妆品卫生规范”粘膜用、婴儿及儿童用化妆品眼部及口唇等细菌菌落总数不得大于500CFU/mL或500CFU/g。其他化妆品细菌菌落总数不得大于1000CFU/mL或1000CFU/g4所有化妆品霉菌和酵母菌总数不得大于100CFU／mL或100CFU／g每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。5二、检查的必备知识1.采样采样应具有代表性。从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL作为检验量。样品应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。及时检验的样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。6二、检查的必备知识1.采样若样品需同时做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。7二、检查的必备知识1.采样如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。8二、检查的必备知识2.供检样品（供试品）的制备水溶性液体样品样品10mL90mL生理盐水1:10供试液9二、检查的必备知识2.供检样品（供试品）的制备油性液体样品②5mL灭菌液体石蜡1:10供试液均质器③10mL灭菌吐温8040~44℃①10mL样品混匀10min④75mL40~44℃灭菌生理盐水40~44℃乳化10二、检查的必备知识2.供检样品（供试品）的制备亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品振荡②90mL生理盐水上清液作为1:10供试液①10g样品15min膏、霜剂若用均质器，混合均质1~2min即可。11二、检查的必备知识2.供检样品（供试品）的制备疏水性半固体样品②10mL灭菌液体石蜡1:10供试液均质器③10mL灭菌吐温8040~44℃①10g样品混匀10min④70mL40~44℃灭菌生理盐水40~44℃乳化膏、霜剂若用均质器，混合均质3~5min即可。12二、检查的必备知识2.供检样品（供试品）的制备固体样品振荡②90mL生理盐水上清液作为1:10供试液①10g样品15min13三、细菌、真菌总数检查1.意义测定总数主要是作为判定化妆品被细菌、霉菌及酵母菌污染程度的标记，也可以观察化妆品中细菌、霉菌及酵母菌的性质和在化妆品中的繁殖动态，以便对样品进行卫生学评价时提供科学依据。14三、细菌、真菌总数检查2.培养基、培养温度和时间检查菌培养基名称培养温度培养时间细菌卵磷脂、吐温80-营养肉汤琼脂36℃±1℃48h±2h真菌虎红琼脂28℃±2℃72h±2h15三、细菌、真菌总数检查3.方法－平皿法数据处理混合平板的制备细菌、真菌的培养检查结果、观察与计数供试液的制备书写检验记录单16细菌、霉菌和酵母菌计数的操作过程对照对照对照对照1.0ml倒置培养48h±1h36℃±1℃卵磷脂、吐温80-营养肉汤琼脂28℃±2℃虎红琼脂倒置培养72h±2h9.0ml稀释液10g/ml供试品9.0ml10-210-11.0ml17三、细菌、真菌总数检查4.操作注意事项1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。2.为防止细菌增殖及产生菌苔，制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。18三、细菌、真菌总数检查4.操作注意事项3.使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附的溶液混入其中。4.注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。遇此情况应重复检验，以确定是防腐剂影响还是操作技术误差。19三、细菌、真菌总数检查4.操作注意事项5.为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，以检验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过程是否无菌操作。6.为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5％的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。20三、细菌、真菌总数检查5.菌落计数及报告方法宜选取细菌、酵母菌平均菌落数30~300之间、霉菌平均菌落数5~50之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。（1）当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数;（2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数21三、细菌、真菌总数检查5.菌落计数及报告方法（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之;（4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之;（5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；（6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU;22例次不同稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数(CFU/mL或CFU/g)报告方式(CFU/mL或CFU/g)10-110-210-31136516420-1640016000或1.6*10422760295461.63800038000或3.8*10432890271602.22710027100或2.7*1044不可计4650513-513000513000或5.1*105527115-270270或2.7*1026不可计30512-3050031000或3.1*1047000-1*1023四、控制菌检查－检查项目（1）阴性对照试验：应无菌生长。（2）阳性对照试验：供试品+阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。（3）供试品控制菌检查：依相应的检查方法进行。24四、控制菌检查－检查流程供试品增菌培养分离培养纯培养染色镜检生化反应试验报告结果25四、控制菌检查－检查流程1.增菌培养目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。26四、控制菌检查－检查流程2.分离培养目的经增殖培养后,被检菌大量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。27四、控制菌检查－检查流程3.纯培养目的只是大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。28四、控制菌检查－检查流程4.染色镜检目的初步鉴定，观察细菌的形态大小。29四、控制菌检查－检查流程5.生化试验目的最终的鉴定依据，结合染色镜检得出实验结果，填写检验报告。30四、控制菌检查－粪大肠菌群检查★粪大肠菌群粪大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。31四、控制菌检查－粪大肠菌群检查★粪大肠菌群检查意义粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染化妆品，若产品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可能存在肠道致病菌并引起疾病，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。32四、控制菌检查－粪大肠菌群检查产酸：黄色产气：气泡产酸产气书写检验记录单不产酸不产气增菌培养供试液的制备配培养基和稀释液检查结果判断44±0.5℃24~28h分离培养蛋白胨水培养最终结果判断44±0.5℃24±2h靛基质特征菌落36±1℃18~24h双倍胆盐乳糖MEMB琼脂液面玫瑰红色紫黑色★粪大肠菌群检查流程图33双倍乳糖胆盐培养基EMB琼脂培养基靛基质试验气泡，培养基呈黄色紫黑色金属光泽玫瑰红色液面34四、控制菌检查－粪大肠菌群检查★粪大肠菌群检查结果报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。35四、控制菌检查－铜绿假单胞菌检查★铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长。36四、控制菌检查－铜绿假单胞菌检查★铜绿假单胞菌检查意义铜绿假单胞菌在特殊情况下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并引起败血症。为保证消费者安全，化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。37四、控制菌检查－铜绿假单胞菌检查最终结果判断增菌培养供试液的制备书写检验记录单分离纯化无菌落或无特征菌落配培养基和稀释液革兰染色、镜检→氧化酶试验绿脓菌素试验生化试验硝酸盐还原试验42℃生长试验明胶液化试验★铜绿假单胞菌检查流程图SCDLP培养基十六烷三甲基溴化铵琼脂36±1℃18~24h36±1℃18~24h特征菌落灰白色、扁平、周围有水溶性蓝绿色素38十六烷三甲基溴化铵平板SCDLP培养基黄绿色菌膜灰白色湿润氧化酶试验粉红/紫红色39绿脓菌素试验盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色硝酸盐还原产气试验N2明胶液化试验明胶培养基（高层）明胶液化40四、控制菌检查－铜绿假单胞菌检查★铜绿假单胞菌检查结果报告被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。41四、控制菌检查－金黄色葡萄球菌检查★金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。42四、控制菌检查－金黄色葡萄球菌检查★金黄色葡萄球菌检查意义金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脏性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。43四、控制菌检查－金黄色葡萄球菌检查革兰染色、镜检→生化试验:血浆凝固酶试验甘露醇发酵试验最终结果判断增菌培养供试品的处理书写检验记录单分离纯化无菌落或无特征菌落配培养基和稀释液36±1℃36±1℃SCDLP培养基或7.5%NaCl肉汤24±2hBairdParker’s或血琼脂24~48h特征菌落灰黑色、边缘有浑浊带、周围有透明带★金黄色葡萄球菌检查流程图44BairdParker’s平板灰/黑色甘露醇发酵试验血浆凝固酶试验血浆凝块液态血浆45四、控制菌检查－金黄色葡萄球菌检查★金黄色葡萄球菌检查结果报告凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。