09-9-24工业微生物--课件1

第二章：工业微生物及菌种的分离、选育和保藏本章主要内容•第一节工业微生物种类及菌种的来源•第二节菌种的分离筛选、培养分离•第三节工业微生物育种•第四节菌种的保藏思考题（第2章）•1.工业化产品生产菌有哪几类，主要生产那些发酵产品？•2.微生物中有哪几种基因表达系统？各有何特征？•3.列表比较细菌、放线菌和真菌的个体形态和菌落形态特征•4.菌种筛选有哪些主要步骤？那几步是关键步骤？请设计放线菌的筛选步骤；•5.如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体?.•6.如何用比浊法测微生物的数量？•7.有那几种工业菌种改良方法？•8.常用那几种诱变剂？菌株诱变主要有那几步？请设计紫外线的诱变育种.第一节工业微生物种类及菌种的来源菌种的来源菌种的来源•根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；•从大自然中分离筛选新的微生物菌种微生物资源非常丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，尤以土壤中最多。有的微生物从自然界中1.分离出来就能够被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行2.人工诱变，得到突变体才能被利用。中国微生物菌种保藏管理委员会(ChinaCommitteeforCultureCollectionofMicroorganisms．CCCMS)•1979年7月在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作会议，委托中国科学院负责担负全国菌种保藏管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。•1)普通微生物菌种保藏管理中-L(CCGMC)；•中国科学院微生物研究所，北京(As)：真菌，细菌。•中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-IV)：病毒。•2)农业微生物菌种保藏管理中心(ACC(，)；•中国农业科学院土壤肥料研究所。•3)工业微生物菌种保藏管理中L(CFCC)；•轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。•4)医学微生物菌种保藏管理中(CMCC)；•中国医学科学院皮肤病研究所，南京(ID)：真菌。•卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。•中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。•5)抗生素菌种保藏管理中中心(CACC)；•中国医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新抗生素菌种常用的工业微生物的种类•目前，人们对微生物特性的认识还是十分不够的，已经初步研究的不超过自然界中微生物总的10％左右。•微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种．•而大规模工业生产的总计不超过一百多种;•微生物酶有近千种，而已在工业上利用的不过四五十种。•可见，微生物资源不仅十分丰富，而且可挖掘的潜力还是很大的现将工业上常用的微生物介绍如下•微生物的种类繁多，•但工业上主要应用者主要有•细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类第一节菌种的分离简介一、菌种的来源•根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；•从大自然中分离筛选新的微生物菌种。1、微生物的特性及工业微生物的要求1.1、微生物的特性有些微生物能在厌氧/好氧的条件下生长有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长有些微生物能进行复杂的代谢有些微生物能利用较复杂的化合物有些微生物能在极端的环境下生长1.2工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染它种微生物或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）生产特性要符合工艺要求尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种选择有下列要求：★要求产率高1）原料要易得、价廉2）发酵条件粗放3）菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。尽量诱变次数少，选择单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株；4）发酵周期短的优点：感染杂菌的机会减少提高设备的利用率5）菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性,稳定性好,菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。6）抗杂菌能力、抗噬菌体强,不易感染噬菌体7）不是病原菌，不产生有害物质和毒素放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源2.1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：2.已工业化产品生产菌的介绍放线菌的形态构造(课件1)放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。放线菌的菌丝（见右图）()根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其形态如下图所示。下图：链霉菌的一般形态和构造（模式图）光学显微镜下观察到的放线菌放线菌菌落形态放线菌菌落放线菌形态放线菌形态霉菌分生孢子分生孢子梗分生孢子梗分生孢子已工业化产品生产菌的介绍2.2、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵现象称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌•已工业化产品生产菌的介绍上海聚瑞生物技术有限公司一家以生物发酵技术生产氨基酸产品的年轻公司。公司的合伙人是在生物发酵领域拥有数十年经验的资深工程师，目前公司拥有发酵法生产L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸等系列产品的生产技术并拥有知识产权。公司的生产基地位于浙江，拥有总容量超过200吨的发酵罐、500平方米的GMP车间、完善的检测分析实验室和熟练工人已及管理人员上海聚瑞生物技术有限的年轻公司。公司的合伙人是在生物发酵领域拥有数十年公司一家以生物发酵技术生产氨基酸产品经验的资深工程师，目前公司拥有发酵法生产L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸等系列产品的生产技术并拥有知识产权。公司的生产基地位于浙江，拥有总容量超过200吨的发酵罐、500平方米的GMP车间、完善的检测分析实验室和熟练工人已及管理人员HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶已工业化产品生产菌的介绍2.3、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌江阴市百圣龙生物工程有限公司(原江阴市星达生化工程有限公司)位于江苏省江阴市霞客镇。本公司是全国酶制剂行业重点生产企业和江苏省高新技术企业。公司于1992年6月在中国首家引进美国先进的酶制剂菌种、专有工艺和生产设备，专业生产耐高温α—淀粉酶、高转化率糖化酶、中温α—淀粉酶等食品级和工业级酶制剂产品，年生产能力8000吨。现在，本公司的产品不仅畅销国内二十多个省、市、自治区；1/3产品已进入欧洲、美国、东南亚等国家和地区的市场。曲霉(Aspergillus)•是发酵工业和食品加工业的重要菌种，已被利用的近60种。•2，000多年前，我国就用于制酱，也是酿酒、制醋曲的主要菌种。•现代工业利用曲霉生产各种酶制剂(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等)、有机酸(柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等)，农业上用作糖化饲料菌种。例如黑曲霉、米曲霉等。曲霉广泛分布在谷物、空气、土壤和各种有机物品上。•生长在花生和大米上的曲霉，有的能产生对人体有害的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1能导致癌症，有的则引起水果、蔬菜、粮食霉腐。曲霉的分生孢子芽孢杆菌孢子梗孢子囊孢子囊轴根霉的孢子囊和孢子囊梗曲霉分生孢子列表比较细菌、放线菌和真菌的个体形态和菌落形态特征。•1.细菌的个体形态：菌落形态：•单细胞球状、杆状或螺旋状圆形或不规则，边缘光滑，或不整齐；大小不一，表面光滑或皱褶；颜色不一，常见颜色为灰白色、乳白色，湿润粘稠。•2.放线菌的个体形态：菌落形态：•呈分枝丝状体，宽度与细菌呈干燥细致的粉末状或茸毛状，•相似，为无隔膜多核菌丝，与培养基结合较紧。•在固体基质上有基内菌丝、气•生菌丝之分。•3.酵母菌的个体形态：菌落形态：•呈圆形或卵圆形或形成假颇似细菌菌落，但比细菌菌落•菌丝，个体比细菌大。大而且厚，湿润粘稠；多为乳白色；•一般圆形；表面光滑•4.霉菌的个体形态：菌落形态：•呈分枝丝状，分枝丝状体与放线菌比较，表面呈绒毛状•菌丝宽度比放线菌大；有或棉絮状，如呈粉末状者则不及•有隔膜菌丝和无隔膜菌丝放线菌细腻致密，与细菌比较，•之分；在固体基质上也有则差异显著。•营养菌丝，气生菌丝和繁殖•菌丝之分菌落形态3、常用的基因表达系统3.1.原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽胞杆菌沙门氏菌生长迅速、蛋白产量高;表达蛋白的纯化、分离及分析快速；外源基因的导入相对容易；已建立了整套表达理论及技术.•已工业化产品生产菌的介绍芽孢杆菌芽孢形态3.2真核细胞表达系统3.2.1酵母(既是微生物又是真核细胞)生长迅速，营养要求不高，易培养；安全性好；比哺乳动物细胞操作简单；具有一定的修饰蛋白的能力。•已工业化产品生产菌的介绍酵母菌形态酵母菌菌落形态3.2.2.中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统具有准确的转录后修饰功能；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；CHO很少分泌自身的内源蛋白。•已工业化产品生产菌的介绍CHO-K1细胞••CHO-K1细胞是实验中非常常用的一个细胞株，在生物制药中使用也非常广泛。•该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。•来源：Cricetulusgriseus(中国仓鼠)卵巢形态：•表皮细胞生长特性：贴壁•培养液：Ham‘sF12K（含2mML-谷氨酰胺，1.5g/LNaHCO3），10%胎牛血清。•传代：吸去培养液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：4到1：8为宜，传代期间培养液更换1-2次）•冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。第二节菌种的分离筛选、培养分离、菌种分离的一般过程土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：•1.自然界中有目的微生物分离的原则菌种资源的开发•工业发酵产物的性质：–菌体物质–生产分解酶类–生产主流代谢产物、次生代谢产物或生物合成产物•菌种筛选的一般原则和基本步骤：–采集菌样：了解目标菌分布情况、首选样品是土壤–富集培养：利用选择性培养基的原理，向所采土样中加入某些特殊营养物，并创造一些有利于待分离对象生长的条件，使样品中少量的能分解利用该营养物的微生物大量繁殖，以提高其在群体中的比例，使之便于分离。–纯种分离–性能测定1.2、采样时要注意的问题气候、水分、空气来源要广结合产品的特点标签：地点、时间、气候等•自然界中有目的微生物分离的原则2、新种分离与筛选的步骤•分离思路•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。•有了优良的菌种，还要有合适的工艺