两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。扩增曲线阈值及CT值荧光定量PCR的数学原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0*(1+Ex)n（n：扩增反应的循环次数；X：第n次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex：扩增效率）在扩增产物达到阈值线时:C(t)valueXCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)由此可见，logX0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。利用相对定量的方法分析目的基因的表达研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-deltaCt法。一、双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。Sample公式如下：双标准曲线法的特点：1、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误差；2、思路直观、条理清晰、应用简便，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行严格的优化；3、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；4、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。二、2-△△CT法公式如下：1、2-△△CT方法的推导PCR指数扩增的公式是：Xn是第n个循环后目标分子数；X0是初始目标分子数；Ex是目标分子扩增效率；n是循环数；CT代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数因此：XT是目标分子达到设定的阈值时的分子数；CT,X是目标分子扩增达到阈值时的循环数；Kx是一个常数；对于内参反应而言，也有同样的公式：用XT除以RT得到：对于使用Taqman探针的实时扩增而言，XT和RT的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K并不一定等于1。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或：XN代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X-CT,R）整理上式得：最后用任一样本q的XN除以参照因子（calibrator，cb）的XN得到：在这里对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：2、方法的假设和应用要使△△CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等或相差小于0.1。2-△△CT法的特点：1、由Delta-deltaCt的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。2、用ComparativeDelta-deltaCt法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。看两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。3、当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。4、这种方法对于样品量少，但研究的基因数目较多的实验特别有用，因为一旦条件优化好之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。Taqman探针、引物设计原则与普通PCR反应相比，荧光定量PCR在反应中加入了荧光物质，用以实时显示反应的进程，Taqman探针法在普通PCR反应体系中加入了与扩增片段互补的一段带荧光标记的核酸序列，SybrGreen法加入了能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响Taq酶的活性进而影响PCR反应的效率。在Taqman探针法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，还要5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72℃，此温度为Taq酶聚合作用的最佳温度；Taqman探针法反应中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活性的同时，还需要Taq酶5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，Taq酶5’-3’外切酶活性的最佳温度为60℃，所以TaqmanPCR反应的一般采用两步法，即95℃变性，60℃复性延伸。与普通PCR反应相比，Taqman探针法PCR反应效率有所降低或对PCR产物扩增长度、Mg2+浓度等其他条件更加敏感。理想的实时扩增曲线不同扩增效率的差异对于Taqman探针法来说，引物及探针的设计必须围绕着保证PCR反应的最大效率这一中心，这样才能保证各个样品间反应效率的一致性，才能最大限度的减少误差。探针设计原则：1、先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；2、探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；3、检测探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；3、Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在40%－70%；4、探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；5、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；6、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。引物设计原则：1、序列选取应在基因的保守区段；2、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；3、典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；4、Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%；5、引物之间的TM相差避免超过2℃；6、引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；7、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；8、Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；9、引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。