不同毒性条锈菌生理小种分泌蛋白基因变异分析

xxxxx大学本科生毕业论文（设计）题目：不同毒性条锈菌生理小种分泌蛋白基因变异分析学院：生命科学学院专业班级：xx级生物技术xx班学生姓名：xx指导教师：xxx教授撰写日期：201x年x月xx日不同毒性条锈菌生理小种分泌蛋白基因变异分析xx生命科学学院摘要：小麦条锈病是世界性小麦病害，在全球大多数小麦产区均有发生，严重威胁小麦粮食生产安全。小麦条锈病是由条形柄锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici，Pst）引起的叶部病害，属担子菌亚门柄锈菌属。通过对CY32（China）、CY23(China)、PK-CDRD(Pakistan）、Pst-78(US)菌种的扩繁，收集到了足量的条锈菌,然后对其用CTAB\SDS法提取条绣菌基因组DNA；通过对重测序结果进行分析，筛选出一个候选分泌蛋白基因striiformis_Gene7472进行测序验证，发现这个基因在四个生理小种之间存在单核苷酸多态性（SNP）、小片段插入缺失（InDel)变异。关键词:小麦条锈病；单核苷酸多态性；短序列的插入/缺失variationanalysisofdifferentisolatessecretoryproteingeneHESheng(CollegeofLifeSciences)Abstract:Wheatstriperustisaworldwidewheatdisease,occurringinmostofthewheatproducingregions,threateningthesafetyofwheatgrainproduction.Wheatstriperust(Pucciniastriiformisf.sp.tritici.Pst)causedbyleafdisease,belongstobasidiomycotinaPuccinia.WeinoculateCY32(China),CY23(China),PK-CDRD(Pakistan),Pst-78(US)onthewheatcultivarsMX169,collectedplentyofstriperust;ThenweextractthegenomicDNAbyusingthemethodofCTAB\SDS,andselectedacandidatesecretoryproteingenestriiformis_Gene7472bycollatingandorganizingthere-sequencingresults.Finallyweidentifytheresultsandfoundthatthegenebetweenthefourisolatesexistsinglenucleotidepolymorphisms(SNP),asmallfragmentinsertiondeletion(InDel)variation.Keywords:Wheatstriperust;SNP;InDel引言小麦锈病是世界性小麦病害，包括条锈病、叶锈病与秆锈病，在全球大多数小麦产区均有发生，严重威胁小麦粮食安全生产。同时，锈菌可借助气流实现高空远距离传播，导致病害在各个小麦产区间流行，是影响粮食安全的重大生物灾害。小麦锈病曾频繁造成包括我国在内的全球小麦主产国毁灭性的产量损失。仅建国后,条锈病在我国就发生了9次大流行，对小麦生产造成了灾难性的影响。特别是1950、1964、1990和2002年的四次大流行分别使小麦减产60亿kg、32亿kg、25亿kg和10亿kg。进入本世纪以来，由于小麦条锈菌毒性变异和新小种产生，小麦条锈病已在我国小麦产区连续流行了近10年，年损失小麦在10亿公斤左右。近年来，小麦锈病在全球的发生和流行引起各国科学家的高度关注，世界各国非常重视小麦锈病研究工作。在诺贝尔和平奖获得者N.E.Borlaug博士的倡导下，国际博伦厄全球麦锈病协作中心（）组织各国科学家开展合作研究，在全球范围内共同抵御锈病对小麦造成的威胁。Hovmøller等在国际学术顶级期刊“Science”上也特别撰文警示，锈病将在世界范围内引致更为广泛而严重的暴发流行。因此，持续有效控制小麦锈病是确保小麦稳产增产的重要保障。小麦条锈菌在小麦上先产生亮黄色的夏孢子堆（urediniospore）和夏孢子（uredium），每个夏孢子堆均可持续产孢数天，由夏孢子堆形成的纵向扩展病斑可以维持较长时间的产孢。随着小麦叶片逐渐衰老，以及不适合其夏孢子生长的逆境刺激下，条锈菌开始形成黑色的冬孢子堆（teliospore），继而产生双孢冬孢子（telium），每个冬孢子细胞都含有一个经过核配形成的二倍体细胞核（姚娟妮等2012）。冬孢子成熟萌发后，产生担孢子（basidiospore）和担子（basidium），担孢子在适宜的条件下可以侵染转主寄主小檗，并在小檗叶片的正面形成性孢子器（pycnium）和性孢子（pycniospore），随后在小檗叶片的背面，与正面性子器相对的地方，产生乳突状的锈孢子器（aecium），锈子器发育成熟后可以释放锈孢子（aecidospore），而锈孢子可以侵染小麦，在小麦上产生条锈菌夏孢子，完成其有性生活史周期[1]。这一惊人的发现证明了小麦条锈菌存在着有性阶段，为更深入的研究小麦条锈病发生流行的规律和病原菌遗传变异的机制提供了重要途径。小麦条锈病菌主要以夏孢子在小麦上完成周年的侵染循环。目前尚未发现病菌的转主寄主。其侵染循环可分为越夏、侵染秋苗、越冬及春季流行四个环节。小麦条锈菌在我国甘肃的陇东、陇南、青海东部、四川西北部等地夏季最热月份旬均温在20℃以下的地区越夏。秋季越夏的菌源随气流传播到我国冬麦区后，遇有适宜的温湿度条件即可侵染冬麦秋苗，秋苗的发病开始多在冬小麦播后1个月左右。秋苗发病迟早及多少，与菌源距离和播期早晚有关，距越夏菌源近、播种早则发病重。当平均气温降至1～2℃时，条锈菌开始进入越冬阶段。一月份平均气温低于－6～－7℃的德州、石家庄、介休一线以北，病菌不能越冬，而这一线以南地区，冬季最冷月均温不低于上述温度的四川、云南、湖北、河南信阳、陕西关中、安康等地则可以菌丝状态在病叶里越冬，成为当地及邻近麦区春季流行的重要菌源基地。翌年小麦返青后，越冬病叶中的菌丝体复苏扩展，当旬均温上升至5℃时显症产孢，如遇春雨或结露，病害扩展蔓延迅速，引致春季流行，成为该病主要为害时期。在具有大面积感病品种前提下，越冬菌量和春季降雨成为流行的两大重要条件。如遇较长时间无雨、无露的干旱情况，病害扩展常常中断。因此常年发生春旱的华北发病轻，华东春雨较多，但气温回升过快，温度过高不利该病扩展，发病也轻。只有早春低温持续时间较长，又有春雨的条件发病重。品种抗病性差异明显，但大面积种植具同一抗源的品种，由于病菌小种的改变，往往造成抗病性丧失。国内外研究表明，病菌毒性变异是导致小麦品种抗病性“丧失”，病害大规模流行的根本原因。因此，揭示小麦病原菌毒性变异的基础是解决品种抗性“丧失”，实现病害持久控制的必由之路。锈菌毒性变异的根源是遗传物质的变异，在分子水平揭示毒性及其变异的物质基础至关重要。生物遗传变异的重要表现是其基因组及其表达的变异，包括基因组序列和结构的变异。序列变异主要有单核苷多态性（SNP）、短序列的插入/缺失（indel）、微卫星或简单重复序列（SSR）和转座子等类型；结构改变主要包括有/无变异（presense/absencevariation，PAV）和基因拷贝数变异（copynumbervariation，CNV），主要为基因组区域大范围的插入、缺失、复制、倒置（inversion）和移位（translocation）[2]。随着新一代高通量测序技术的出现，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。日益完善测序技术和低廉的成本正在使基因组研究发生革命性变化，大大促进了锈菌基因组学研究。2011年，两个植物锈菌-杨栅锈菌（Melampsora.larici-populina）和小麦秆锈菌（P.graminisf.sp.tritici）基因组测序工作同时完成，并对其中专性寄生菌基因组特性进行了分析[3]。比较基因组发现，活体专性寄生菌与腐生菌、兼性寄生菌之间基因谱系中保守基因没有显著变化。但具有明显的活体专性寄生菌的典型特性，如分泌组中存在种内特异候选效应子、类效应子小分泌蛋白，氮、硫吸代谢途径有缺失，氨基酸及寡肽的膜转运蛋白家族扩增等[4]。本课题组也于近期已完成了中国小麦条锈菌生理小种CYR32的测序以及CY23(China)、PK-CDRD(Pakistan）、Hu09-2(Hungary)、104E137A-(Australia)、Pst-78(US)的重测序工作，比较基因组学分析将大大加深和促进对条锈菌的进化、毒性变异及致病机制的研究。小麦锈菌菌基因组数据为我们全面解析病菌的毒性变异分子机制提供了信息资源和物质基础。基于全基因组关联分析的方法为研究变异规律提供了思路。2009年KentaroYoshida实验室对水稻稻瘟菌进行重测序，全基因组关联分析显示三个新的无毒基因（AVR-Pia,AVR-Pii,AVR-Pik/km/k）[5]。最近，HIGS（Host-InducedGeneSilencing，寄主诱导的基因沉默）已应用于植物病害研究，为小麦锈菌功能基因组学研究提供了新的方法和途径。Daniela（2010）等应用HIGS研究小麦白粉菌病，表明寄主诱导的基因沉默通过沉默效应基因Avr10的获得证明，效应基因Avra10可以抑制真菌的发展但不能消除其存在。小麦锈菌关键生长发育和代谢基因、关键效应蛋白基因的鉴定，将为借助HIGS技术利用这些基因来实现持久控制小麦病害提供基因资源和技术保障[6]。总结，通过对菌系CY32(China)、CY23(China)、PK-CDRD(Pakistan）、Pst-78(US）的扩繁，收集到了足量的夏孢子；然后对其用CTAB\SDS法提取条绣菌DNA；通过对重测序结果基因组分析，选择了两个候选分泌蛋白基因striiformis_Gene7472进行测序验证，发现四个生理小种之间存在SNP、InDel变异，为下一步进行荧光定量分析以及功能分析奠定了基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1植物材料及培养材料取自不同国家的菌系CY32(China)、CY23(China)、PK-CDRD(Pakstan）、Pst-78(US)。优良小麦种子、营养土、蛭石、塑料盆等植物培养材料。1.1.2培养基及常用溶液配制LB培养基（1L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0，高压灭菌15min。DNA提取液:200mmol/LTris-HCl(PH7.4)、25mmol/LEDTA(PH8.0)、250mmol/LNaCl、0.5%SDS。1.1.3各种试剂及耗材异丙醇、75%乙醇、镊子、移液枪、1.5ml离心管（EP管）、枪头、小研磨棒、玻璃棒、小试管、MasterMix、PCR热循环仪，移液枪、枪头、96孔样板、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、琼脂糖凝胶电泳仪、微波炉、称量纸、三角瓶、量筒、恒温培养箱、离心机、超低温冰箱、高压灭菌锅、涡旋混匀器、凝胶成像体统、电热恒温水浴锅、超净工作台、有PCR仪、电泳仪、常温离心机、高速冷冻离心机、全智能光照培养箱、恒温摇床、分析天平、显微镜、通风橱、纯水仪等。1.2实验设计及技术路线1.3实验方法1.3.1小麦的种植以及条锈菌的收集：小麦条锈病菌属于专性寄生菌，尚不能进行离体培养（不能在人工培养基上进行培养），限制了通过分子手段对小麦条锈病菌群体遗传结构和生理小种变化的研究，只能通过侵染小麦，收集，再侵染，再收集的方法富集小麦条锈菌，以进行下一步的研究。1)准备阶段：①材料：森林土壤、蛭石、筛好的细黄土、小麦种子（铭贤169，特点不抗小麦条锈病，即易被侵染），小花盆，托盘