不同浓度的Cyt-C在W800上的Raman谱图浦化工131009冯如恒

1南京工业大学化工学院化工专业开放实验研究报告题目：不同浓度Cyt-C在氧化钛上的Raman谱图班级、学号：浦化工1310、P1001131009姓名：冯如恒指导教师：刘畅成绩：指导教师（签名）：2016年7月21、课题背景如今人们面对环境污染、食品卫生、公共安全等诸多方面的问题，传统的检测方式已经不能适应时代的发展，越来越需要一些新型检测手段来应对这些安全危机，表面增强拉曼技术的出现给这些分析和研究带来了极大方便。表面增强拉曼又简称为SERS(Surface-EnhancedRamanScattering)。1974年Fleischmann等人在吸附在粗糙银电极上的吡啶上观察到一个增强的拉曼信号，这就是SERS研究的起源[1]。经过30多年的发展，SERS作为一种在分子层次无损害的快速、敏感的方法，在分析、化学和生物学领域等方面都受到了广泛的关注，已被广泛研究和应用于化学检测中[2]。特别是在表面科学、光谱学和生物化学检测等领域，SERS逐渐成为一种高效的、高灵敏性的表面吸附物的检测手段，甚至可以实现单一分子的检测[3-4]随着时代的发展，学术界对SERS的研究也不断加深。当前，普遍认可的SERS机理有电磁机理和化学机理两种，其中电磁机理占据主导地位。电磁机理就是上述的金属表面电子跃迁产生表面等离子体共振效应。其主要原理是入射光与基底表面之间的相互作用，信号增强的原因主要是考虑基底表面局域电磁场的放大从而对表面吸附分子拉曼散射的产生贡献。金属材料表面存在大量可以自由活动的电子，我们称其为等离子体。等离子体能够自发地集体振荡，人们称其为等离子体振荡。不同的金属材料产生的等离子体振荡频率不同，它还能够被电子或者被入射光波激发，产生表面等离子体共振。而且，在临近的纳米颗粒体系之间，其表面的等离子体耦合产生“热点”，这些“热点”能极大的增强电磁场，使某些金属具有超高的SERS灵敏度[5]。SERS研究30多年的研究以来，被人们所认可的化学增强机制则分为两种：（1）金属纳米表面和被吸附分子之间的化学键作用；（2）金属纳米表面和被吸附分子之间的电荷转移机制（CT）。但是这两种机制都建立在同一个基础之上：吸附分子与基底之间的化学相互作用。被检测样品的分子与所用基底之间产生化学吸附是拉曼信号化学增强的必要前提。其中电荷转移增强机制通常包括四个步骤：（1）在激发光线照射下，金属费米能级附近的电子吸收光子被激发，从而跃迁到能级更高的轨道上，而在费米能级以下的轨道中产生了空穴，所以在金属一侧形成了电子-空穴对；（2）电子由于吸收了光子能量从而转移到吸附分子的低空轨道能级（LUMO）上，此时待测样品的分子与金属表面会生成新的化学键，通常都会形成表面配合物；（3）电子再次跃迁回到金属，此时分子的某些振动能级会产生一些变化，使待测样品的分子处于振动激发态；（4）跃迁回金属的电子会和金属内部的空穴发生复合，辐射出一个拉曼散射光子[6]。SERS基底SERS基底的制备一直是SERS技术研究的重要方面，这是因为虽然SERS检测结果由物质的结构所确定的，但探测极限及探测的灵敏性由靠基底所决定。SERS基底的制备对于扩大SERS的研究范围和应用领域起着重要的作用。SERS基底的发展不仅可以拓宽SERS技术的应用，还可以为SERS机理研究提供模型，不断推动SERS技术的发展。SERS基底需具备以下特征［7］：（1）具有可用于灵敏分析的高SERS活性；（2）需要在不同使用条件下保持稳定，具有高的重现性；（3）具有高的选择性，不受杂质分子干扰；（4）制备过程需简单，且应易于储存。氧化钛SERS基底氧化钛是一种具有优良光学性质的半导体，在工业和科研领域都有着广阔的3发展空间。在光的激发下，可以释放出电子。这种优良的光学活性，使氧化钛成为一种优秀的催化剂、吸附剂。氧化钛的纳米粒子还可以杀死有害细菌[8]。氧化钛作为一种典型的半导体材料，在稳定性、经济性和生物相容性方面都有明显的优势[9]。介孔氧化钛晶须还可以被用作运输载体来运载抗癌药物，表现出优秀的细胞无毒性，并且拥有极强的光动力来杀死癌细胞。所以采用氧化钛作为SERS基底，对于半导体的SERS活性基底增强机制的研究具有重要意义。但是，半导体材料通常会具有较宽的带隙，从而使可见光利用率较低。所以很多的SERS研究者常常会采用离子掺杂的方法来增加半导体能级，来达到有效的电荷转移。人们已经做过对氧化钛纳米粒子进行Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+等离子掺杂的实验来检测其拉曼信号的增强效果。但往往面临如金属掺杂从而导致光稳定性降低、形成复合中心等问题。现在部分研究者们开始通过改变氧化钛形貌来提高其拉曼信号的增强效果。细胞色素C细胞色素C(cytochromeC)又名细胞色素丙、细丙，是一种蛋白酶，是生物氧化过程中的电子传递体，它由104个残基和一个辅基（血红素），五个α螺旋和两个反平行的β-片组成。该整体结构是一个直径大约为3.4nm的球形。该血红素铁与组氨酸（His18）和甲硫氨酸（Met80）之相配合，并且两个乙烯基血红素环通过硫醚键与两个半胱氨酸（Cys14和Cys17）共价键合。其拥有高水溶性和重要生物功能，是一个良好研究性能的血红素蛋白，它是呼吸链的电子载体，在细胞凋亡的过程中，其能转运到细胞溶质中，参与DEVD-半胱天冬酶的激活[10]。细胞色素C是位于线粒体膜接口上，由于电子传递链中的氧化还原电位增加，因此驱动而产生电荷转移。大量的研究者通过对电极和固定化细胞色素C的多相电子转移研究模仿一些在一个真正的生物界面Cyt-c的基本特征。它在酶存在时，对组织细胞的氧化、还原反应起酶促作用。细胞色素C广泛存在于真核细胞和细菌中。1925年Keilin正式将其命名为“细胞色素C”。细胞色素C主要被用作充当细胞呼吸激活剂，临床上是各种组织缺氧急救的主要辅助治疗药物，并还具有促进修复骨髓造血功能、再生受损肝细胞以及明显减轻放化疗引起的白细胞减少症等功能。细胞色素C还对细胞的凋亡起到重要的作用。但由于细胞色素的来源不同，其氨基酸组成序列也不尽相同。不同种属的细胞色素具有不同的相对分子质量。SERS光谱探针能检测出细胞色素C吸附物种，包括那些主要是氧化还原不活跃的性质，而电化学测量结果只能反映细胞色素C的电化学活性。2、材料的制备与表征2.1氧化钛晶须的制备2.1.1实验试剂及仪器本研究中使用的实验药品详见表2-1-1，为分析纯、化学纯级别，没有经过进一步的纯化处理。实验中所用的水均为去离子水。表2-1-1试验试剂名称、规格、产地等信息药品分子式纯度厂家水合氧化钛TiO2•nH2OAR南京市油脂化学厂碳酸钾K2CO3CP上海化学试剂厂盐酸HCLAR上海凌峰化学试剂有限4公司氯化钠NaClAR上海凌峰化学试剂有限公司氢氧化钠NaOHAR上海凌峰化学试剂有限公司注：分析纯AR、化学纯CP表2-1-2试验设备名称、型号、厂家等信息设备名称型号厂家马弗炉ModelSX2-2.5-12南京高温电炉厂温控仪ModelAI-708厦门宇光电子技术有限公司XDRBrukerD8德国布鲁克公司拉曼光谱仪HoribaHR800日本崛场有限公司电镜SEMQUANTA-200日本Hitachi公司电子天平FA2004N上海精密仪器有限公司烘箱GZX-9246上海博讯实业有限公司2.1.2实验流程TiO2晶须制备方法：首先，将水合氧化钛（TiO2•nH2O）与碳酸钾混合加热到880℃生产钛酸钾晶须。然后用0.1mol/L的HCl溶液来处理钛酸钾晶须，从而去除钾离子产生H2Ti4O9晶须。产物经过滤后，用去离子水洗涤，随后在烘箱中60℃烘干。最后H2Ti4O9晶须在800°C烧结2小时，然后自然降温。待其降到室温之后，经过研磨，便可根据烧结温度的不同，获得标号为W800的TiO2晶须基底。3、SERS性能测试3.1实验准备3.1.1实验试剂及仪器本研究中使用的实验药品详见表3-1-1，均为分析纯级别，没有经过进一步的纯化处理。实验中所用的水均为去离子水。表3-1-1试验试剂名称、规格、产地等信息药品分子式纯度厂家磷酸二氢钾KH2PO4AR上海凌峰化学试剂有限公司磷酸氢二钠Na2HPO4AR上海凌峰化学试剂有限公司细胞色素CC42H52FeN8O6S2AR上海凌峰化学试剂有限公司氧化钛P25TiO2AR德国赢创工业集团注：分学纯AR表3-1-2试验设备名称、型号、厂家等信息5设备名称型号厂家拉曼光谱仪HoribaHR800日本崛场有限公司电子天平FA2004N上海精密科学仪器有限公司3.1.2实验流程pH=7.4的PBS缓冲液制备：(1)称取9.078gKH2PO4溶解于1L的去离子水中，配制1/15M浓度的KH2PO4溶液；(2)称取11.876g的Na2HPO4·12H2O溶解于1L的去离子水中，配制成1/15M浓度的Na2HPO4·12H2O溶液；(3)将18.2%(体积分数)KH2PO4溶液和81.8%Na2HPO4·12H2O混合，得到PH值约为7.4的PBS缓冲溶液。不同浓度的细胞色素C溶液制备：称取0.3125g细胞色素C溶解于50mL的pH=7.4的PBS缓冲液中，得到5×10-4mol/L的细胞色素C溶液。以此溶液为基础稀释分别制得浓度为5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L的细胞色素C溶液。3.2Raman检测及结果图3-2-1不同浓度的Cyt-C吸附在W800的Raman谱图图3-2-1显示的是不同浓度的Cyt-C吸附在W800的Raman谱图。此图是由测浓度分别为5×10-4mol/L、5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L的细胞色素C溶液带有W800氧化钛基底的4个样品而获得。Cyt-C/W800的制样方法为：先取研磨后的W800基底，用玻片压平。再在上面滴加四种不同浓度的细胞色素C溶液，待冻干后进行测量。通过此图还可以发现，其中5×10-4mol/L浓度的样品峰值最高，5×10-7mol/L6浓度的样品峰值最低，随着溶度的增大，峰值也逐渐增高。各官能团均有显著增强效果，其中V19(A2g)的拉曼信号增强程度最高。由此得出结论：细胞色素C的浓度越大，其拉曼信号越强，说明越容易被检测。4、小结以氧化钛晶须为基底，使细胞色素C很好的吸附在二氧化钛纳米粒子上进行拉曼检测。结果表明，氧化钛晶须作为基底对细胞色素C的拉曼信号有显著的增强效果。随着溶液浓度的增大，细胞色素C的拉曼信号也会增强。5、参考文献[1]M.Fleischmann,P.J.HendraandA.J.Mcquilla,NanostructuredsurfaceenhancedRamanscatteringsensorplatformwithintegratedwaveguidecore,Chem.Phys.Lett.,1974,26,163–166.[2]XiaotianWang,WenshengShi,GuangweiSheandLixuanMua,Surface-EnhancedRamanScattering(SERS)ontransitionmetalandsemiconductornanostructures,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,4756–4795.[3]S.M.NieandS.R.Emory,Surface-EnhancedRamanScatteringasanEmergingCharacterizationandDetectionTechnique,Science,1997,275,1102–1106.[4]K.Kneipp,Y.Wang,H.Kneipp,L.T.Perelman,I.Itzkan,R.R.DasariandM.S.Feld,Nanoparticlecoatednanostructuredsurfacesfordetection,catalysisanddeviceapplications,Phys.Rev.Lett.1997,7