中国林蛙皮抗菌肽的提取及其抗菌活性的研究

中国林蛙皮抗菌肽的提取及其抗菌活性的研究王战勇1，井静1，苏婷婷2(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁抚顺113001；2.辽宁石油化工大学化学与材料学院，辽宁抚顺113001)摘要:采用甲醇提取中国林蛙皮肤中的抗菌肽。并考察了影响抗菌肽粗提物抑菌率的各个因素：如提取时间、提取温度、料液比和pH值等因素，通过正交试验确定了获取抗菌肽粗提物的最佳条件。即：提取时间为24h，提取温度为-20℃，提取料液比为1：25，提取液pH值5.0。此条件下抗菌肽粗提物抑菌率可达75.22%。抗菌肽粗提物对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌以及真菌均有一定抑制效果。对各测试菌株的最低抑制浓度分别为：金黄色葡萄球菌和链球菌为0.25mg/mL；枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为0.5mg/mL；蜡样芽胞杆菌为1.0mg/mL；白色念珠菌、酿酒酵母和毛霉为2.0mg/mL；根霉为4.0mg/mL。关键词：中国林蛙；抗菌肽；正交试验；抑菌活性中图分类号：Q516文献标识码:ATheStudyonExtractionandAntimicrobialActivityofAntimicrobialPeptidesfromSkinofRanachensinensisWANGZhanyong1,JINGJing1,SUTingting2(1.SchoolofEnvironmentalandBiologicalEngineering,LiaoningShihuaUniversity,Fushun113001,China；2.SchoolofChimicalandMaterialSciences,LiaoningShihuaUniversity,Fushun113001,China)Abstract:AntimicrobialpeptideswereisolatedfromSkinofRanachensinensisbymethanol.Somefactorofinfluenceonantimicrobialpercentageofantimicrobialpeptidescrudeproductwasreviewed,suchastime,temperature,ratioofsampleandextractionsolventandpH.Theoptimumconditionwaschosenbyorthogonalexperiment.Theoptimumconditionsareasfollows:Theratioofsampleandextractionsolventis1:25.Theextractingsolutionwasdisposedfor24hat-20℃.AndthepHofextractingsolutionis5.0.Undertheoptimizeconditionsantimicrobialpercentageofantimicrobialpeptidescanreach75.22%.Antimicrobialpeptidescrudeproductcouldeffectivelyinhibitthegrowthofseriesmicroorganisms,includingGram-positivebacteria,Gram-negativebacteriaandfungus.TheMICsofthetestedmicroorganismsweretestedasfollows:TheMICofStaphylococcusaureusandStreptococcusis0.25mg/mL,theMICofBacillussubtilisandEscherichiacoliis0.5mg/mL,theMICofBacilluscereusis1.0mg/mL,theMICofCandidaalbicans,SaccharomycescerevisiaandMucoris2.0mg/mL,theMICofRhizopuis4.0mg/mL.Keywords:Ranachensinensis,AntimicrobialPeptidesOrthogonalexperiment,AntimicrobialActivity两栖动物皮肤在自然进化过程中形成了防御病原微生物的三套防御系统，相应地具有与这些防御系统相适应的特定结构。皮肤抗菌肽是其中先天防御系统的主要组成部分。两栖动物皮肤抗菌肽具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点[1,2]。这使其在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天有望成为新一代的临床抗菌药物[3,4],并成为当前的研究热点。中国林蛙(Ranachensinensis)是我国传统的名贵药用动物，俗称哈士蟆，其应用部分主要是雌性个体的输卵管。东北地区年产林蛙10亿余只，大量的蛙皮尚未被有效的开发应用。林蛙皮肤湿润、裸露，为抵御环境有害因子侵袭，在自然选择的过程中，经长期进化，其皮肤分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性物质[5~6]。本研究在大量实验的基础上进一步优化了林蛙皮抗菌肽的提取条件，并进行体外抗菌作用研究，通过对一些具有代表性的菌株进行考察，以了解其抗菌谱范围及抗菌强度，为进一步探讨其抗菌作用机理，将其开发为低毒、高效药用资源或食物保鲜剂提供实验依据。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1实验材料取林蛙油后的中国林蛙干品由抚顺市东星林蛙精品研究所提供。从提取取林蛙油后的中国林蛙上剥取作者简介：王战勇（1978.4），男，辽宁抚顺，讲师，在读博士，主要从事微生物学及生物化学研究。蛙皮，尽量除去肌肉等杂质，用剪刀将林蛙干皮剪碎，蒸馏水清洗，自然干燥，备用。1.1.2实验菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、链球菌(Streptococcus)、白色念珠菌（Candidaalbicans）酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)。以上菌种均为本实验室保藏菌种。1.2实验方法1.2.1样品制备将预处理的样品使用甲醇于一定温度浸提一段时间。取浸提液进行减压蒸馏，再经冷冻干燥，得到抗菌肽粗提物。以大肠杆菌为受试菌，接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养24h。将粗提物用1ml蒸馏水溶解，取100μl，加30μlLB培养基和70μl菌液(菌液浓度为5×103CFU/ml)并混匀，37℃、150r/min摇床孵育1h，取100μl涂布于LB平板，37℃培养过夜，计菌落数。以蒸馏水为对照组。计算抑菌率。实验重复3次，计算平均值。%100-(%)对照组菌落数实验组菌落数对照组菌落数抑菌率1.2.2抗菌肽粗提物的抑菌效果将所有供测试的菌种移接入相对应的培养基（细菌和酵母菌使用LB培养基；真菌使用PDA培养基[7]）上，细菌置于37℃恒温培养箱内培养24h，霉菌、酵母菌于28℃培养48h。用接种环挑取菌体或孢子置于50ml无菌生理盐水中，混匀制成菌体悬液或孢子悬液。采用杯碟法测定抑菌效果，菌体悬液或孢子悬液均匀涂布于相应的平板培养基,将牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入0.2ml浓度为0.5mg/ml的抗菌肽溶液，于恒温培养箱中培养(细菌37℃，24h；霉菌、酵母菌28℃，48h),观察培养结果，测定平皿内抑菌圈直径大小，实验重复3次，计算平均值。抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)的测定[8]：将样品配制成一系列浓度梯度的溶液。向对应固体培养基平板中分别移取不同浓度的稀释液各1.0mL，再分别移取各菌悬液0.2mL，均匀涂布后,在适宜温度下培养，以不长菌的最低浓度为最小抑菌浓度。2结果与讨论2.1抗菌肽粗提物最适提取条件的确定2.1.1提取时间对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与甲醇按料液比1∶20混匀，室温（25℃），pH为6.0的条件下提取不同时间，取上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌率。结果如图1所示。06121824303642485401020304050607080抑菌率(%)提取时间(h)图1提取时间对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.1Effectofextractingtimeonantimicrobialpercentageofantimicrobialpeptidescrudeproduct由图1可知，提取时间对抗菌肽粗提物抑菌率有一定的影响。提取时间小于24h时，随着提取时间的延长，产物得率显著增加。24h以后继续增加提取时间，抑菌率提高幅度不大。因此要在提取时间24h以上才能有较好的提取效果。2.1.2提取温度对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与甲醇按料液比1∶20混匀，pH为6.0，提取时间24h的条件下于不同温度提取，上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌率。结果如图2所示。01020304050607080抑菌率(%)提取温度(oC)-20425图2提取温度对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.2Effectoftemperatureonantimicrobialpercentageofantimicrobialpeptidescrudeproduct为最大限度保持抗菌肽活性，提取温度不宜过高，本实验只选取-20℃，4℃，室温（25℃）三个条件考察。由图2可知，随着提取温度的升高,提取物的抑菌率逐渐下降，而提取温度在-20℃时能最大限度保持提取物活性，提取物有较高的抑菌率。2.1.3料液比对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与甲醇按不同料液比混匀后，-20℃，pH为6.0的条件下提取24h，上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌率。结果如图3所示。01234567010203040506070801：401：351：301：201：251：15提取物得率(%)料液比图3料液比对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.3Effectofsampleandliquidratioonantimicrobialpercentageofantimicrobialpeptidescrudeproduct由图3可知，随着料液比的增大，抗菌肽粗提物抑菌率呈现先升高后下降的趋势。在料液比为1：25~1：30时，提取物有较高的抑菌效率。2.1.4pH对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与调节为不同pH值的甲醇按料液比1：25混匀后，-20℃的条件下提取24h，上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌率。结果如图4所示。3.03.54.04.55.05.56.06.57.001020304050607080抑菌率(%)提取时间(h)图4pH对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.4EffectofpHonantimicrobialpercentageofantimicrobialpeptidescrudeproduct由图4可知，提取剂的pH对提取物的抑菌率有较大的影响，随着pH的增大，抗菌肽粗提物抑菌率呈现先升高后下降的趋势。在pH为5.0时，提取物有较高的抑菌效率。2.1.5正交试验根据影响提取物的各个单因素的考察，设计一个L9（34）正交试验，实验方案如表1所示。实验结果如表2、表3所示。表1正交试验因素水平表Table1Factorsandlevelsoforthogonalexperiment水平实验因素A提取时间（h）B提取温度(℃)C料液比DpH118-201：204.522441：255.0336251：305.5表2正交试验直观分析Table2Theintuitionisticanalysisoforthogonalexperiment实验号实验因素抑菌率（%）ABCD1111155.212122269.343133340.224212373.375223165.296231257.327313255.398321347.219332158.35