中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理

药物代谢动力学实验考查知识点整理第一部分：HPLC使用注意事项1、HPLC组成：泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪2、反相色谱：分离机理：“反相色谱”固定相极性小于流动相极性常用流动相：乙腈、甲醇，水3、色谱柱的分类：按填料：球形、无定形按含碳量：C18、C8按应用：分析柱、制备柱、预处理柱按粒径：150mm*4.6mm,5μm等按填料类型：正相柱、反相柱、手性柱4、键合相色谱柱的优缺点：优点：稳定不易流失；应用广泛，可使用多种溶剂；消除硅羟基的不良影响；缺点：pH得在3~8范围内5、C18柱的活化：90%10%90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗30min6、流动相：使用之前需超声脱气（PPT18）目的：色谱泵输液准确提高检测性能保护色谱柱流动相脱气的方法：加热，抽真空，超声，通惰性气体流动相组成：流动相配置：缓冲溶液现用现配，不要储存时间过长，避免pH值发生变化和成分分解，影响色谱分离的效果；有机溶液和缓冲液使用前均需经0.45μm微孔滤膜过滤；流动相使用前脱气。7、常用定量方法：外标法内标法（准确麻烦）内标物的要求：化学结构与待测品相似；样品中不存在；不与样品组分发生化学反应；保留值与待测值接近；浓度相当；与其他色谱峰分离好8、样品的预处理：目的：除杂质；浓缩微量成分；改善分离；保护色谱柱；提高检测灵敏度方法：高速离心，过滤，选择性沉淀，衍生反应；液固萃取、液液萃取沉淀蛋白的溶剂：有机溶剂：乙腈、甲醇强酸：三氯乙酸、过氯酸盐：50%硫酸铵、10%TCA分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水第二部分：实验设计1、考虑问题：动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度大概范围2、分析方法建立：色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方法、风量下限与标曲范围第三部分：实验相关条件与数据处理实验一：1、采血点设计一般原则为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要4~6个采样点。整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。为保证最佳采样点，建议在正式试验前，选择2~3只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。2、动物给药方式：股静脉注射3、麻醉：腹腔注射20%乌拉坦4、采血方式：眼眶静脉丛采血（0.3ml/次）5、蛋白沉淀方式：10%高氯酸，涡旋，15000rpm10min,取100ul上清二次离心6、非那西丁色谱条件流动相：50mM磷酸盐缓冲液（6.8g磷酸二氢钾加入到152mL的氢氧化钠溶液（0.1mol/L）中，并稀释到1L）：乙腈（60:40）色谱柱：岛津ShimadzuVP-ODS;150×4.6;5μm检测波长：254nm柱温：40℃进样体积：20μL6、参数计算由曲线线性判断为一房室模型，参数计算如下：参数公式值C0由y=9.511e-0.02令x=0得9.511μl/mlT1/2由y=9.511e-0.02令y=0.5C0得34.66mink由T1/2=0.693/k得0.02min-1VdVd=X(给药量)/C0X=1.25ml*2mg/ml=2.5mg262.8mlCLCL=k*Vd5.25min-1ml-1MRTMRT=1/k50.01minAUCAUC=X/CL480μg.min参数非房室值k由-k/2.303=-0.0110.025min-1AUCAUC0~100min=278.56AUC100~∞=C100min/k=18.7AUC0~100min+AUC100~∞=278.56+18.7297.14μg.minAUMCAUMC0~100min=9030AUMC100~∞=t100minC100min/k+C100min/k2=3141.1AUMC=AUMC0~100min+AUMC100~∞12171μg*min2/mlMRTMRT=AUMC/AUCMRT=1/k40.96min/40minC0C0=Div/VSS=2.5mg/344.65ml7.253μl/mlT1/2无CLDiv/AUC=2.5mg/297.14μg.min8.41min-1ml-1VssVSS=Div.AUMC/AUC2=2.5mg*12171.1/297.142344.65ml实验二：1、肝微粒体的制备方法版本一：获取肝脏：大鼠禁食不禁水24小时后取肝脏，组织匀浆：称重剪成碎块后加入匀浆液制成匀浆，差速离心：匀浆液4℃9000g离心15min，弃去沉淀和脂肪层取上清液于100000g离心管中离心20min,弃上清，沉淀用pbs轻轻冲洗。重悬沉淀：用10ml匀浆液重悬，冻存管分装后置-80℃冰箱内保存蛋白定量：BCA法版本二：大鼠拉颈椎处死,开腹取肝脏,用滤纸吸干水分,称质量。立即放入冰冷的蔗糖溶液中清洗,用剪刀剪成碎块,反复清洗至无血色。加4倍肝质量的蔗糖溶液,在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆,再超声分散30s,4C下10000r/min-离心20min。上清液用四层纱布过滤除漂浮脂物,滤液在4C下50000r/min离心60min,弃上清液,沉淀用焦磷酸钾缓冲液悬浮均匀,在4C下50000r/min离心60min,沉淀即为肝微粒体。用TrisHCl缓冲液悬浮均匀,体积为原上清液的1/4即可,分装于塑料管中,于-80C保存,采用Lowry法测定肝微粒体蛋白浓度版本三：2、NADPH体系:葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)10mM葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G-6-P-OH)1U/mLβ-NADP+0.5mM氯化镁5Mm3、温孵实验步骤：肝微粒体（0.2mg/mL,80μL），非那西丁溶液,37℃水浴预温孵5min,加入NADPH体系溶液（启动剂，40μL），37℃水浴温孵，30min,加入冰甲醇（终止试剂，100μL），终止温孵,涡旋1min，高速离心（12000r/min）10min，转移上清液200μl4、数据处理双倒数法1/V的截距为1/Vmax,1/[S]的截距为-1/Km