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第一章绪论1.1埃博霉素介绍1.1.1简介随着人类受恶性肿瘤的威胁逐年增加,新颖抗肿瘤药物的研发迫在眉睫。埃博霉素类药物是一种微生物来源类药物,具有微管稳定作用,其选择性高、活性强、毒性较低,有望取代紫杉醇成为新一代抗肿瘤药物,具有巨大的市场前景。埃博霉素(epothilone)是一类由纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)产生的具有抗肿瘤活性的大环内酯类化合物。与传统的抗癌药物紫杉醇的抗肿瘤机制一样,但埃博霉素的分子结构简单、水溶性好、毒副作用较小、抗肿瘤谱较广,能够更好地抑制肿瘤细胞的增殖,并且埃博霉素可发酵生产,是一种具有广阔开发潜力的新型抗肿瘤化合物。因此,自从1995年发现埃博霉素的抗癌活性后,其得到了包括生物学、化学、医药学等多方面的广泛而深入的研究。由美国施贵宝公司开发的埃博霉素B内酰胺衍生物Ixabepilone(商品名伊沙匹隆),于2007年10月16日获得食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration)批准在美国上市,这是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物。主要的天然埃博霉素化合物一些天然的埃博霉素从图可见,埃博霉素是16元环的一类大环内酯化合物,在C15位置连接了一个含噻唑环的侧链。由发酵制备时,埃博霉素A和B是主要产物,埃博霉素C-F是次要产物,但可以C-F经从A或者B一步反应可以得到可以。埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性可以和紫杉醇媲美,甚至更强,尤其是埃博霉素B,其活性比紫杉醇强10-100倍。在C12位上的有甲基取代,以及C12-C13双键换成环氧基团后,埃博霉素的活性得到极大地提高。埃博霉素的化学结构是由Sorangiumcellulosum(黏细菌纤维堆囊菌)产生的次级代谢产物,其结构为16元内酯大环为中心体,噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物(如图)埃博霉素的活性示意图1.1.2应用埃博霉素的抗肿瘤作用机理与紫杉醇相似,即抑制微管解聚。埃博霉素在p-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中显示很强的抗肿瘤活性,这种肿瘤细胞系紫杉醇是杀不死的,加之埃博霉素比紫杉醇有更好的水溶性,且毒副作用很小,被公认为21世纪最有效的抗癌药物。由美国施贵宝公司开发的埃博霉素B内酰胺衍生物Ixabepilone(通用名为伊沙匹隆),于2007年10月16日由食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration)批准在美国上市,伊沙匹隆单药用于治疗蒽环糖苷类抗生素、紫杉烷衍生物和卡培他滨治疗无效的转移性或局部进展的晚期乳腺癌;可与卡培他滨联用用于治疗蒽环糖苷类抗生素和紫杉烷衍生物以治疗无效的转移性或局部进展的晚期乳腺癌,这是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物类药物。2007年9月24日,施贵宝公司向EMEA提出在欧盟集中上市的申请,2008年11月20日,欧洲人用药品委员会(CHMP)对该申请做出负面裁定并建议其不上市,随后公司提出复审,直到公司主动撤回该申请时,CHMP的审查仍一直在进行。在致EMEA官方信件中,百时美施贵宝公司称撤回上市申请是由于他们在复审程序中提供的信息尚不足以改变委员会对伊沙匹隆做出利益小与风险的评价。埃博霉素可能是目前所有药物中最为昂贵的品种,以美国施贵宝公司的埃博霉素B衍生物(伊沙匹隆)注射剂为例,15mg/支平均批发价(AWP)921.96美元,45mg/支的平均批发价(AWP)2765.89美元,直至2008年销售收入已突破1亿美元。1.2丙酮酸激酶介绍1.2.1简介丙酮酸激酶缩写式为ATP:丙酮酸-2-O-磷酸转移酶。在糖酵解系统里,它是催化形成第二个ATP反应的酶。能以磷酸烯醇(phosphoenolpyruv-ate)丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP•ΔGo1=-7.5kcal。除需要二价金属离子外(Mg2+和Mn2+)外,还需要一价金属离子(K+.Rb+,Cs+),在生理上起作用的大概是K+。分子量约25万。是催化ADP为ATP的形成,结果是形成丙酮酸的终产物。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸酯和ADP转变成丙酮酸和ATP的磷酸基转移酶,是糖酵解过程中的主要限速酶之一,因此丙酮酸激酶(PK)是糖酵解中的三大关键酶之一。在哺乳细胞株中,丙酮酸激酶有4种同工酶并呈组织特异性,分别为L型、R型、M1型和M2型,通常均以酶的活性四聚体形式存在,根据组织不同的代谢功能,它们具有显著的不同调控机制与动力学特性,其中L型主要存在于肝脏和正常肾脏的近曲小管;R型存在于红细胞;M1型主要存在于骨骼肌、心脏和脑;M2型主要表达于肺正常肾脏的远曲小管、胚胎和未分化或增生的组织。其中PKL和PKR由基因L编码,通过不同的组织特异性启动子而分别表达于肝细胞和红细胞中。PKM1、PKM2由M基因编码,在转录过程中由前体mRNA经不同选择性剪切的产物,PKM1的外显子为9,主要存在成熟组织如脑组织与骨骼肌,与PEP底物的亲和力最高,不能被磷酸化和被别构化调控;PKM2的外显子为10,其负责二聚体转化成四聚体的C端56个氨基酸与PKM1存在差别,主要存在一些分化组织、具有核酸合成特性的细胞中如胚胎细胞。但随着胚胎形成,PKM2被不同组织的同工酶替代,有趣是,肿瘤形成过程,其它同工酶消失,PKM2酶则高度表达,这给癌症治疗奠定新的生物基础。研究表明,当恶性肿瘤发生时,PK的组织特异性同工酶(L型、R型、M1型PK等)表达减少,在癌基因编码的激酶作用下,M2一PK可在肿瘤细胞中呈过度表达并且其丝氨酸(Serine,Ser)和酪氨酸(Tyrosine,Tyr)位点均发生磷酸化,使得原先具有高度活性的四聚体解离为无活性的二聚体形式,并占据主导地位,即TUM2一PKt”。1.2.2作用丙酮酸激酶M2一PK以四聚体形式存在时活性高,与底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)亲和力强,而以二聚体形式存在时则与之相反。TUM2一PK与PEP的亲和力很低,导致磷酸烯醇类物质的堆积,这有利于肿瘤细胞不是糖酵解供能而转向核酸合成的方向进行,此相对于糖酵解的过程,可称之为谷氨酸酵解过程,以保证细胞中的能量供给。细胞增殖是一个耗能过程,若细胞无限增殖,细胞会因能量供应不上而死亡。PK在阻止细胞死亡的调节中发挥着重大作用。PK催化PEP是其磷酸转移到二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate,ADP)或二磷酸鸟苷(Guanosinediphosphate,GDP)上,同时产生丙酮酸、三磷酸腺苷(ArI’P)或三磷酸鸟苷(Guanosinetriphosphate,GTP),糖酵解过程中在PK的作用下导致能量的净生成。因此丙酮酸激酶可调控ATP:ADP和GTP:GDP的比率以及一磷酸腺苷、腺苷酸激酶、磷酸果糖激酶的水平。一磷酸腺苷水平的提高可以减少辅酶A、三磷酸鸟苷以及三磷酸胞苷合成,从而抑制DNA的合成和细胞增生。M2一PK通过这种机制来调控细胞增生以及能量的转换及供给。在肿瘤细胞中,M2一PK二聚体和四聚体的比例受肿瘤蛋白和能量代谢介质的调节而产生变化,以达到适应肿瘤代谢的需要。研究表明,四聚体型与二聚体型M2一PK的比率由ATP、1,6一二磷酸果糖、丝氨酸(Serine,Ser)以及不同的癌蛋白(pp60v一8rc、HPV一16E7)之间的相互作用来调控。在有足够氧气供应的实体瘤中,谷氨酸酵解提供大量的丙酮酸。这些谷氨酸酵解和糖酵解中产生的丙酮酸用来合成乳酸、谷氨酸和脂肪酸,从而释放出在糖酵解过程中甘油醛3一磷酸脱氢酶作用下产生的氢,进而保证肿瘤细胞中能量的供给。可见,TUM2一PK在肿瘤新陈代谢中是发挥及其重要的作用。1.3代谢调控1.3.1简介在工业发酵领域,发酵微生物学家研究探索发酵微生物的调控机制,通过控制器代谢调控使其高产具有商业价值的产物(如:某种代谢物、酶),即达到最佳的调控效果,从而产生最大的经济效益。解除微生物的调控机制可以通过营养控制或经典的基因手段以绕过或去除负调控而增强正调控机制来实现,可用方法有:诱导,碳源、氮源及磷酸盐的营养调控和反馈调控。微生物代谢一般首先将高分子的碳源分解为小分子,然后转变为氨基酸、核苷酸、维生素、碳水化合物、脂肪酸,最后转变为蛋白质、酶、核酸、多糖、脂用于生长。通过发酵可生产用一般化学方法合成难度大或成本高的物质。微生物要生产出这些物质,首先必须合成大量的酶,然后使其协调发挥作用。微生物的代谢必须保证这种协调性,在代谢过程中仅生产所需的合适浓度的酶。当生产出了足够量的这种特殊物质后,微生物通过其调节机制就不再合成与其相关的酶,且原有酶的活性降低。因此细胞是根据环境情况适量地生产代谢产物,这使得一个物种能同自然界中其它生命形式相竞争而生存下来。具有调控功能的一些重要机制有:底物诱导、营养调控及反馈调节。发酵的本质即从自然界中分离出特定的野生型微生物并在实验室中进行调控修饰或定向修饰,由此可得到高产某种初、次级代谢产物的菌株。代谢调控研究的主要对象是为人类生产大量的抗生素、酶、氨基酸、有机酸、溶剂、醇类、多糖、维生素、蛋白质、生理活性物质、色素等有用产物的工业微生物及培养技术,主要是细菌、放线菌、酵母、霉菌等,当然现在又扩大到藻类、病毒、植物、动物等的培养技术。代谢控制发酵的研究任务为掌握微生物的生长、繁殖、发育、分化、代谢等生命活动的规律,以及和周围环境之间关系,从而控制工业微生物的生命活动(代谢途径),为提高发酵过程的生产、效率和创立新的发酵过程奠定理论基础。1.3.2基本思路1、应用营养缺陷型突变株切断代谢支路;2、渗漏突变株的应用;3、抗结构类似物突变株的应用;4、营养缺陷型回复突变株的应用;5、增加前体物质的合成;6、增加细胞渗透性,去除细胞内的终产物;7、一些特殊调节机制的利用;8、条件突变株的应用;选育不生成副产物的菌株。1.3.3常用方法1、诱导:在一定的变化范围内,微生物可以通过结构蛋白、转运蛋白、毒素、酶等形式的变化来适应条件的变化,由此以适应特殊的生态环境。微生物中的一种特殊物质——诱导物能诱导、启动酶及代谢物的产生。2、碳源代谢物抑制(CCR):CCR广泛分布于微生物中,其主要功能是:当环境中有多种碳源时,CCR就选择性利用碳源。在这种机制的调控下细胞首先代谢培养基中的最优碳源,这时,利用其它底物来合成酶的反应就会受到抑制,直到这种占主导地位的底物耗尽为止。3、氮调控:氮源调控的酶有:用于监测和去除水中硝酸盐的硝基还原酶、用于尿酸测定及其去除的尿酸酶、用于日用品和洗涤剂的蛋白酶等。4、磷酸盐调控:磷调控包括特异调控和一般调控。无机磷酸盐的特异性负作用是由于它能抑制磷酸酶。避免磷酸盐抑制效应且最大限度地扰乱微生物生长的其它方法还有通过经典遗传学方法分离抗磷酸盐负作用的突变株,有关这种方法的报道有:非多元大环内酯抗生素复合物。5、反馈调控:反馈调控就是生物合成和代谢可以自己调控自己的机制。这种机制可以调控已存在的酶的活性(反馈阻化),也能终止合成(反馈抑制)。1.4立题目的、意义世界卫生组织公布,全世界每年患癌症人数大幅度增长,至今每年检验出的新增癌症患者数已经超过1400万名。这与2008年的统计结果1270万人相比,人数明显增加。同期,癌症患者的死亡人数也有所增加,从过去的760万人增加到820万人。据WHO估计,到2025年,全球癌症患者人数将达到1900万。WHO称众多癌症中,肺癌是最常见的癌症,它主要是由吸烟引起的。肺癌患者人数在全球已经达到180万例,约占患癌总人数的13%。并且,乳腺癌也显示出一种“急剧上升”的趋势,从2008年之后,乳腺癌的发病率和死亡率就一直呈上升状态,目前已经成为140多个国家中女性的常见癌症之一。在发展中国家普及乳腺癌的诊断和治疗技术是一件迫在眉睫的事情。癌症的高发危险性是抗癌治疗药物的研发、生产和市场状况受到了愈来愈广泛的关注。微生物来源的抗癌药物近年来不断涌现,发展广谱、低毒、高效、新型的抗癌药物已经成为研究的方向。埃博霉素被誉为最具有潜力的抗肿瘤新药之一,埃博霉素与紫杉醇一样具有稳定微管蛋白的活性。在20世纪90年代,紫杉醇广泛应用于临床,临床实验表明,紫杉
本文标题:丙酮酸激酶在埃博霉素合成中的应用
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