EZ-Bio生物纯化技术和系统-PowerPoint

生物-蛋白色谱分离技术和系统EZ-BioSystem2010年4月FPLC(快速蛋白液相色谱)FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fastproteinliquidchromatography），是由液体柱层析引入气相色谱理论，并且对固相基体和键合相进行了改革，配用输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。FPLC根据蛋白质的之间的各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行分离。是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，具有快速、高分辨率等特性，还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。生物-蛋白的色谱分离技术和系统生物/蛋白的分离纯化大量的使用了液相色谱(层析)技术和设备.生物/蛋白的液相色谱分离纯化和我们目前的FLASH中压快速制备色谱原理是一致的,只是使用中根据生物/蛋白的分离纯化的特点有些地方有特殊的要求:生物纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。生物/蛋白的分离纯化的系统通常也叫FPLC—快速蛋白液相系统.FPLC与目前使用的FlashChromatography区别FPLCFlashChromatography填料种类多，尤其以葡聚糖和琼脂糖基体的常见一般采用硅胶基体的填料柱内洗脱压力以凝胶基体为例，填料的特性决定耐压很低，最小只有0.7PSI，最高也不超过50PSI100-200PSI流量（4g举例）填料规定了最大线性流速,一般单位是cm/小时,如最大50cm/h换算到4克柱是0.6ml/min填料的线性流速比较大,一般1000cm/h,换算到4克柱一般是5-20ml/min或更高运行时间一般时间都很长（如0.2ml/min，可运行十几个小时）15-30min（一般实验）流动相含盐的缓冲溶剂，对金属材质有腐蚀甲醇/正丁醇等有机溶剂生物-蛋白的色谱分离技术和系统生物-蛋白的色谱分离技术和系统测定—分子量、等电点PI选择—层析方法纯化—1.大量粗品-大颗粒离子交换介质2.硫酸氨样品-疏水层析3.糖类分子-外源凝集素亲和层析4.单抗、抗原-亲和层析5.重组蛋白6.包涵体蛋白7.肽类_来源天然萃取，合成肽和重组肽三种8.核酸、病毒9.寡核苷酸10.脱盐、小分子去除11.疫苗纯化12.抗生素聚合物分析13.基因治疗用病毒载体14.基因治疗用质粒15.中草药有效成分(通常指蛋白或多糖,分子量1000以上的物质)生物-蛋白的液相色谱分离步骤和目标生物-蛋白的色谱分离技术和系统在线检测器除了和FLASH快速制备色谱一样,选配标准的紫外UV(200-400nm)或者紫外-可见UV-VIS(200-790nm)检测器以外,也采用在线示差RI检测器.选用紫外检测器需要根据样品特点确定流通池的光程长度,制备型紫外检测器一般是0.5mm,样品吸光度弱需要增加.生物-蛋白的色谱分离技术和系统•利穗科技(苏州)科技有限公司基于成熟的FLASH快速制备色谱和系列耗材产品,于2010年正式推出EZ-Bio系列生物-蛋白分离纯化系统,包括：BASIC梯度洗脱系统梯度泵加自动组分收集系统梯度泵、在线UV检测器、自动组分收集配合工作站软件的全控系统梯度泵、在线示差检测器、自动组分收集配合工作站软件的全控系统EZ-BioBasicEZ-BioUV-VISShodexR1-102示差EZ-Bio硬件和软件性能泵陶瓷泵，耐酸液，耐碱液，长寿命流速0.2-25ml/min，高精度，脉冲小压力100PSI或更高压力，调节压力保护填料梯度类型台阶或线性梯度，随意修改试管架100支收集模式手动、峰收、全收检测器UV(200-400nm)、UV-VIS(200-800nm)、示差检测器工作时间最长可达1000min，过夜无需看管●支持组分收集器的各种收集方式及多种试管架●实时显示试管收集情况，方便地试管与色谱峰进行对应●生成客户定义的梯度程序●存储及执行色谱分离方法●控制仪器，按UV吸光度信号收集●生成纯化报告●强大的实时控制功能：实时收集/不收集切换、暂停/恢复运行、试管强迫切换、实时修改并运行梯度曲线●试管收集满自动暂停保护●试管架循环运行功能生物-蛋白的色谱分离技术和系统生物-蛋白的色谱分离常用填料包括•亲和层析•凝胶过滤/分子筛层析技术•离子交换层析•疏水作用层析技术•反相层析生物-蛋白的色谱分离技术和系统生物-蛋白色谱分离由于使用了非常多种类的填料,而每种填料的特性不同,需要根据填料特性来确定色谱分离的技术条件,包括:Factors因素•LoadpH负载pH值•Loadconductivity负载电导率•Massload质量负荷•Loadconcentration负载浓度•Washvolume洗脱体积•WashpH洗柱pH值•Washconductivity洗脱电导率•ElutionpH洗脱pH值•Gradientelution梯度洗脱•Stepelutionlevel分步洗脱水平•CutOD切割外径•ElutionAdditive洗脱添加剂•Mediatype媒体类型•Bedheight床的高度•Columnsize柱大小•Flowvelocity流速亲和层析亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA；配体和金属；生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍亲和层析凝胶过滤/分子筛层析技术凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍SephadexG)BIo-GelPHydrophobicgels)SuperdexSephacrylSepharoseCL)Utro-gelACA生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍凝胶层析凝胶层析选用指南•Superdex中高压系统高稳定性高选择性高重现性•Sephacryl中低压系统大分子分离宽分离范围•Superose中压系统高重现性宽分离范围•Sephadex脱盐组分分离生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍纯化蛋白质抗体脂类，激素，维他命多肽核酸，病毒多糖天然重组脱盐SephacrylSephadexSephacrylSuperdexSuperdexSuperdexSuperdexSuperoseSepharoseLH-20G-25,G-10凝胶层析生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍离子交换层析阳离子交换基阴离子交换基预装住功能Minibeads超高分辨率分离MonnoQ高分辨率半制备Source15高流速半制备Q、SP、SepharoseHighPerformance方法探索和浓缩样品SP、CM、DEAE、ANXSepharoseFast、Capto快速初步纯化易于放大生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍离子交换层析常用的阳离子交换剂离子交换剂可电离基团可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍常用的阴离子交换剂离子交换剂可电离基团可电离基团结构DEAE-纤维素（强减型）二乙基氨基乙基AE-纤维素（弱减型）氨基乙基PAB-纤维素（弱减型）对氨基苯甲酸DEAE-纤维素二乙基氨基乙基（中弱减型）DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基（中弱减型）生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍疏水作用层析技术利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍反相层析以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍高盐浓度的粗品或样品样品划分富集纯化精制GFACGF脱盐脱盐GFGF脱盐IEXGFHICGFIEX洗脱GFIEXHICAC：亲和层析IEX：离子交换层析GF：凝胶过滤HIC：疏水作用层析RPC：反相层析生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍方法功能富集纯化精制样品初始条件样品结束条件IEX高分辨率高容量高效★★★★★★★★★离子强度低样品体积不限离子浓度高PH改变样品浓度高HIC分辨率高容量高高效★★★★★★离子强度高样品体积不限离子强度低样品浓度高AC高分辨高容量高效★★★★★★★★具体键和条件样品体积不限具体洗脱条件样品浓度高GF高分辨率★★★★样品体积小流速限制缓冲体系改变样品稀释RPC高分辨率★★★★需要有机溶剂样品浓度高生物活性可能改变生物-蛋白的色谱分离常用填料和技术介绍应用案例生物-蛋白的色谱分离技术和系统待纯化样品推荐方法及填料硫酸氨样品SephadexG-25，HiTrapHICTestKit糖类分子Sepharose6MB单抗、抗原Mabselect，ProteinG，ProteinA，CNBr包涵体蛋白Superose12，Sepharose6FF中草药有效成分SephadexLH-20，HiTrapSP，HiTrapQ，Sephacryl肽类SuperdexPeptideHR，SOURCE30RPC核酸、病毒SephacryS-1000，SF、SuperoseSepharoce4FF寡核苷酸MonoQ，SOURCEQ脱盐、小分子去除SephadexG10,G15,G25,G50疫苗Sepharose4FF，SephacrylS-500HR抗生素聚合物分析SephadexG10基因治疗用病毒载体SOURCE15Q基因治疗用质粒QSepharoseXL,SOURCE15Q应用示例