pdf-丝素蛋白作为组织工程生物材料的研究进展

ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,February2008,Vol.22,No.2·192·丝素蛋白作为组织工程生物材料的研究进展王宏昕李敏【摘要】目的介绍丝素蛋白作为生物材料在组织工程应用中的研究进展及前景。方法广泛查阅国内外关于丝素蛋白生物材料的研究文献，对丝素蛋白生物材料的性能及其在组织工程中的应用进行分析总结。结果丝素蛋白具有生物降解性和生物相容性等特点，支持多种细胞的黏附、分化和生长，可应用于人工韧带、血管、骨、神经组织等方面。修饰改性后的丝素蛋白可更好地应用于组织工程。结论丝素蛋白是一种良好的生物材料，在组织工程中有广泛的应用前景。【关键词】丝素蛋白组织工程生物材料研究进展中图分类号：R318.08Q813文献标志码：ARECENTPROGRESSONSILKFIBROINASTISSUEENGINEERINGBIOMATERIALS/WANGHongxin,LIMin.CollegeofLifeSciences,FujianNormalUniversity,FuzhouFujian,350108,P.R.China.Correspondingauthor:LIMin,E-mail:[e-mail]【Abstract】ObjectiveTosummarizethelatestdevelopmentsinsilkfibroinasbiomaterialsanditsapplicationsintissueengineering.MethodsTherecentoriginalliteratureonsilkfibroinasbiomaterialswereextensivelyreviewed,illustratingthepropertiesandapplicationsofsilkfibroinbiomaterialsintissueengineering.ResultsSilkfibroinasbiomaterialshadgoodbiocompatibilityanddegradability.Itsupportedthecelladhesiondifferentiationandgrowth.Itwasusedforartificialligament,vessel,bone,nerveandsoon.Aftermodification,silkfibroincouldbeextensivelyusedintissueengineering.ConclusionSilkfibroinisagoodbiomaterial,whichhasagreatpotentialapplicationsintissueengineering.【Keywords】SilkfibroinTissueengineeringBiomaterialResearchprogressFoundationitems:NationalNaturalScienceFoundationofChina（30570956）;DevelopmentandReformCommissionFoundationofFujianProvince（2006-781）组织工程的核心是建立由细胞和生物支架材料构成的三维空间复合体，材料在其中起关键作用。作为组织工程研究的人工细胞外基质，支架材料为细胞的生长、繁殖、新陈代谢以及形成新组织提供支持。目前研究较多的有可降解高分子材料、陶瓷类材料、复合材料和生物衍生材料等[1]。丝素蛋白因具有独特机械特性和生物相容性，将其应用于临床修复、组织工程支架材料及作为改性材料方面有更大潜力。1丝素蛋白性能丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶而得的纤维状蛋白质，由1条H链和1条L链通过S-S键结合而成，主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。丝素蛋白在制备为生物材料后，其力学性能随存在形式发生改变，生丝拉伸实验的断口显微分析显示，丝素蛋白膜在干燥环境和有机环境中易断裂。丝素蛋白作为无毒、无刺激的基金项目：国家自然科学基金资助项目（30570956）；福建省发展和改革委员会资助项目（2006-781）作者单位：福建师范大学生命科学学院（福建闽侯，350108）通讯作者：李敏，教授，博士导师，研究方向：基因的结构和功能及生物材料，E-mail:[e-mail]生物材料原料，具有良好透气性和透湿性，可被蛋白酶水解降解。体内移植后因丝素蛋白引发的异体反应，主要与移植点和丝纤维的表面性能有关。丝纤维用于临床上已经有几十年历史，如用作手术缝合线等。近年研究发现，丝素蛋白作为生物材料有以下优点[2]：① 较其他天然纤维机械特性好，能与许多高性能的纤维毗美；②可加工成膜支架或其他形式；③表面易化学共价修饰黏附位点和细胞因子；④可通过遗传工程改造丝蛋白成分来调节相对分子质量的大小、可结晶性和可溶性；⑤可部分生物降解，在体内外降解速率缓慢，降解产物不仅对组织无毒副作用，还对周围组织有营养与修复作用。1.1丝素蛋白的生物降解性丝素蛋白可降解吸收，但需时较长，因为蛋白质水解反应通常由一种异体反应控制，而吸收速率与移植点、机械环境、健康状况、生理特点、种类及丝素纤维直径有关。因蛋白酶作用点的不同，不同的酶对丝素蛋白的降解程度各异。Li等[3]使用α-糜蛋白酶、胶原酶ⅠA、蛋白酶ⅩⅣ对多孔丝素膜的体外酶降解行为研究发现，丝素膜在37℃、1.0U/mL蛋白酶ⅩⅣ作用15d降解70%，胶原酶ⅠA降解52%，α-糜蛋白酶降解中国修复重建外科杂志2008年2月第22卷第2期·193·32%。降解过程中丝素膜内孔孔径逐渐扩大，至完全崩解。丝素膜经不同酶降解后平均相对分子质量由小到大依次依为：蛋白酶ⅩⅣ、胶原酶ⅠA、α-糜蛋白酶，经蛋白酶ⅩⅣ降解后的制品一半以上是游离氨基酸。Horan等[4]将蚕丝线浸入37℃、1mg/mL蛋白酶ⅩⅣ中降解，丝素肽链长度、丝纤维断裂强度和疲劳强度及质量均降低，7d后溶液中有游离蛋白纤维及碎片；凝胶电泳实验表明，丝素蛋白的相对分子质量由原来的30万降低至2.5万左右，表明蚕丝比较适于较长时期的缓慢降 解。1.2丝素蛋白的生物相容性生物相容性是指材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理及化学反应。植入人体的生物材料必须无毒、无致敏性，对组织、血液和免疫等系统不产生不良反应。去除丝胶的丝素蛋白纤维不会引起T细胞调节的体内应答，可以支持细胞黏附、分化和组织形成。Dal等[5]将三维网膜丝素蛋白支架植入大鼠皮下6个月后，被上皮、血管等新生组织填充，伴少量巨噬细胞和极个别多核巨细胞，但无T细胞免疫反应发生，也无纤维化生成。通过免疫组织化学证实有血管内皮细胞特异表达产物、血管性假血友病因子存在，显示其具有良好的生物相容性以及引导了网状连接组织生成，同时有血管生成，保证了网状连接组织的生存和持久力。但是支架未降解，与皮下组织整合在一起，有效地诱导组织修复重建和再生作用。1.3丝素蛋白与细胞培养通常将材料置于细胞生长环境中，观察细胞在材料表面或内部的附着速度、增殖以及细胞形态，以判断材料在细胞环境下是否适应。作为构成软骨、筋膜、细胞间质等的胶原蛋白，是人体内含量最多的蛋白质，生理性质和材料性能独特，具有较低抗原性、良好细胞适应性和增强皮肤代谢作用等，广泛存在于皮肤、骨骼与结缔组织中。丝素蛋白具有类似胶原蛋白的性质，能促进细胞生长。丝素蛋白因含有细胞结合结构域，利于细胞粘连，可作为胶原蛋白的替代品。Yamada等[6]研究发现丝素蛋白膜可促进人皮肤成纤维细胞生长，并在丝素蛋白的氨基末端获得两个促进皮肤成纤维细胞生长的氨基酸序列。Unger等[7]比较了人的内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、角化细胞和成骨细胞在丝素纤维上的生长情况，结果显示除内皮细胞外，所有细胞均能沿三维空间扩散，当细胞覆盖纤维表面后，其余细胞开始向纤维间隙伸展。细胞之间形成组织样结构，连接紧密。内皮细胞的情况不同，可能与内皮细胞本身性质有关。2丝素蛋白的应用2.1丝素蛋白人工韧带和血管韧带由束状致密结缔组织构成，能介导正常的关节运动及维持关节稳定。对于蚕丝的力学特性研究发现，其强度和刚度数值与人体韧带非常接近。Altman等[8]将多根蚕丝制成组织工程十字韧带，方法是将30根单纤维丝组成1小股，每6小股成1小束，每3小束成1大股，最后6大股成1大束，直接用作韧带基质。经扫描电镜、DNA定量以及胶原含量等测试显示，该支架材料能支持成人BMSCs的生长、扩散以及分化，提示丝素蛋白是制作人工十字韧带的良好支架材料。随着纤维材料和生物医学材料的不断发展，有孔隙的人造血管不断出现，并用于动物实验和临床研究。家蚕丝素与人体角蛋白、胶原蛋白结构十分相似，具有极好的人体生物相容性。我国始于1957年研制蚕丝人造血管，目前上海丝绸研究所已制成多种类型和不同直径的真丝人造血管。Tamada等[9]报道将丝素蛋白硫酸化后具有阻止血凝的作用，可用于制造人工血管。丝素蛋白作为需求量很大的人造血管高新材料，已开始在日本应用。2.2丝素蛋白软骨和骨组织工程关节软骨组织工程修复的问题之一是软骨-材料交互作用影响了细胞生长行为，如细胞表达和基质沉淀。但丝素蛋白支架材料却不会造成去分化形成纤维细胞。文献报道，用覆盖丝素蛋白的超薄玻片研究丝素蛋白与软骨的初始黏附行为，该结果为软骨重建中设计支架表面的黏附性能提供了有用的信息[10]。Meinel等[11]首次将丝素蛋白做成三维多孔丝素蛋白支架用于骨组织工程研究，先将人BMSCs种植于支架，再植入鼠头盖骨创伤模型，说明丝素蛋白可用于骨重建和再生，表现出机械稳定性和持久性。Hofmann等[12]用不同孔隙直径的丝素蛋白支架培养人BMSCs，分别比较112～224µm和400～500µm两种孔隙直径的丝素蛋白支架材料，发现可通过支架几何学形状控制骨组织工程构建。如果在丝素蛋白中导入带电化合物，可加速其与钙、磷酸团的凝集，进一步将带有负电荷的HA结晶中的基团紧密凝聚，其钙凝集量比未处理的丝素蛋白有显著增加，用这种方法在丝素表面形成结晶物，经X线透射验证含有人骨的主要成分，证明丝素蛋白具有骨结合性和附着性。2.3丝素蛋白神经组织工程各种创伤导致的周围神经断裂和缺损，目前采用手术直接吻合和自体神经移植两种方法修复，效果均不甚理想。科学家尝试研制用于神经修复的外科植入ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,February2008,Vol.22,No.2·194·式导管，使受损神经再生、修复。丝素蛋白材料已用于韧带和骨组织工程，为了证明其可用于神经嫁接等，Yang等[13]评价了丝素蛋白用于外周神经组织工程的生物相容性，观察到丝素蛋白基质与神经突和外周神经组织有良好的组织相容性，可支持大鼠背根神经细胞生长，并有利于雪旺细胞成活，在细胞表型和功能方面无显著的细胞毒性，该项研究为丝素蛋白应用于神经组织工程提供了实验基础。今后的研究方向是利用其制备组织工程神经用于外周神经损伤的修复重建，对其进行体内体外生物相容性评价，并寻求提高此材料生物降解性的有效方法。2.4丝素蛋白修饰改性后作为支架材料的应用丝素蛋白结构性质决定了它是一种极具潜力的细胞生长基质材料，但其力学性质和体系结构常不能满足一些特殊应用的要求，而合成的高分子材料在这方面有其独特优势。用合成高分子材料对丝素蛋白进行表面改性，能综合利用两者优势，按不同的应用目的制备出符合不同要求的复合材料。Gupta等[14]将丝素蛋白溶解于特殊的“离子溶液”，将成拓扑形状的支架材料用于细胞培养，结果表明其拓扑结构对细胞生长、增殖、分化和表达有影响，但无副作用，该项研究为丝素蛋白作为生物材料提供了多元化的应用前景。Hu等[15]报道了重组类人胶原与丝素蛋白共混支架用于肝组织工程的研究。重组类人胶原加入丝素蛋白共混后，不但亲水性增加，而且保持了原有的机械性能。人类肝癌细胞培养发现，共