USP35NF3061非无菌制剂的微生物检查微生物计数

USP61培训专题总述计数培养基生长能力测试和方法适用性产品检验检验方法提供了在有氧条件下嗜常温菌和真菌的定量计数方法。（该方法不适用于含活性微生物作为活性组分的产品）如供试品具有抗菌活性，尽可能移除或中和。如使用灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。如使用表面活性剂进行样品制备，应证明其对微生物无毒性及其与所用灭活剂的相容性。总述计数方法：薄膜过滤法平皿计数法最大概率法（MPN）：用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适合用于霉菌倾注平板法表面涂布法back计数培养基生长能力测试和方法适用性生长能力测试计数方法适用性生长能力测试：总则菌液制备阴性对照培养基生长测试结果判断总则供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。名词缩写解释TAMC：TotalAerobicMicrobialCount总需氧微生物数TYMC：TotalYeastsandMoldsCount霉菌酵母菌总数TSA：大豆酪蛋白消化琼脂TSB：大豆酪蛋白消化肉汤SDA：萨布罗葡萄糖琼脂SDB：萨布罗葡萄糖肉汤PDA：马铃薯葡萄糖琼脂试验菌株试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干粉菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。试验菌株的种类：白色念珠菌(ATCC10231)黑曲霉(ATCC16404)真菌金黄色葡萄球菌（ATCC6538)铜绿假单胞菌(ATCC9027)枯草芽孢杆菌(ATCC6633）细菌菌液制备•按表1规定程序培养各试验菌株。•取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液制成适宜浓度的菌悬液；•如用于混悬黑曲霉芽孢，可在缓冲液中加入0.05%吐温80。制备好的悬浮液在2小时内使用，如存放在2℃-8℃则可延长至24小时内使用。•作为制备黑曲霉或枯草芽孢杆菌的营养菌体新鲜悬浮液后并稀释的一种替代方法，可制备稳定芽孢悬浮液并取一定体积的芽孢悬浮液用于试验接种。稳定的芽孢悬浮液可在有效期内存放于2℃-8℃。阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应以稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。培养基生长测试每一批成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应进行适用性检查。按表1所述，接种不多于100cfu的菌液到大豆酪蛋白消化肉汤和大豆酪蛋白消化琼脂或萨布罗葡萄糖琼脂，各自进行培养。结果判断对于固体培养基，测得的促生长作用与标准接种液的计算值相比，相差不得超过两倍。对于新鲜配制的接种液，微生物的生长应与上一次检验并批准的培养基批次的结果相似。液体培养基若与上一次检验并批准的培养基批次的结果相似，可清晰地看见微生物的生长，亦认为是适宜的。back计数方法适用性样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在情况下的微生物的恢复生长结果与解释非脂质脂质不溶于水产品气雾剂或喷雾剂透皮贴剂水溶性产品一般可分根据供试品得到理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超出1小时。样品制备水溶性产品：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化培养基将供试品溶解或稀释（一般制备成1:10的稀释液）。必要时，调节pH值至6-8.如需进一步稀释则使用相同的稀释液。不溶于水的的非脂质产品：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化培养基将供试品溶解或稀释（一般制备成1:10的稀释液）。对于润湿性差的物质可加入表面活性剂，如1g/L吐温80助混。必要时，调节pH值至6-8。如需进一步稀释则使用相同的稀释液。脂质产品：用无菌十四烷酸异丙酯溶解，或将供试品与最少量并能使供试品乳化的无菌吐温80或其它非抑制性无菌的表面活性剂混合。小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释剂使成1∶10供试液，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用含适宜浓度的无菌吐温80或其他非抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释。气雾剂或喷雾剂：在无菌条件下将供试品转移至膜过滤装置或无菌的容器中以便下一步取样。从每个待测容器中取出全部含量或指定剂量的供试品进行检验。透皮贴剂：去掉透皮贴剂的防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上。在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。然后将其转移至适宜体积并含有灭活剂（如吐温80或卵磷脂）的稀释液的容器中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。接种与稀释将足量的细菌悬浮液加入按“样品制备”项下制备的样品和对照（不含待验材料）中，所得接种液中细菌含量不得过100cfu。接种的悬浮体积不得超过稀释供试品体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低的稀释倍数的样品进行计数方法适用性试验。如因为产品具有抗菌活性或溶解性差而不能实现时，应采取适宜的方法对供试品进一步处理。如样品的生长抑制作用无法用其它方法避免，则可将其中和、稀释或过滤后加入等份的微生物悬浮液。中和/去除抗菌活性供试液接种后，按下列“微生物在产品存在下的恢复生长”项中所述规程进行培养。所得微生物的数量应与对照液中微生物数量相似。若微生物的生长受到抑制（减少超过一半），可采用下述方法消除供试品的抑菌活性，确保其结果有效性。（1）增加稀释液或培养基体积；（2）在稀释剂中加入适宜的中和剂；（3）薄膜过滤；（4）结合（1）、（2）、（3）使用。（中和剂可用于中和抗菌剂的活性（参见表）。优先在灭菌前将中和剂加入至稀释剂或培养基中。使用时，应进行空白对照，以证明其有效性和对微生物无毒性）干扰物质可用的中和剂或中和方法戊二醛，水银剂亚硫酸氢钠酚类，乙醇，醛类，吸附物稀释醛类甘氨酸季胺类化合物（QACs），对羟基苯甲酸酯，双胍类化合物卵磷脂碘酒，对羟基苯甲酸酯聚山梨酯水银剂巯基醋酸盐水银剂，卤化物，醛类硫代硫酸盐乙二胺四乙酸盐（EDTA）镁或钙离子表：消除干扰物质常用的中和剂或中和方法中和剂——可用于中和抗菌剂的活性（参见下表）。（1）优先在灭菌前将中和剂加入至稀释剂或培养基中。（2）使用时，应进行空白对照，以证明其有效性和对微生物无毒性）若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么所接种的微生物分离失败可看成是供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对一些特定的微生物具有抑制作用，而对试验菌株之外或试验菌株中代表性较差的其他菌株没有抑制作用。因此，根据微生物的生长和特定的可接受标准，用最高稀释级别的供试液进行检验。产品存在情况下的微生物恢复生长应对所列的各种微生物进行单独检验。只对加入试验菌株的微生物进行计数。倾注平皿法计数法薄膜过滤法平板计数法最大概率数（MPN）表面涂布法薄膜过滤法—所用的滤膜标示孔径不得大于0.45μm.选择滤膜的材质应保证其细菌截留的能力不受供试品及其他组分影响。每种微生物使用单独的薄膜过滤器。按“样品制备”、“接种于稀释”、“中和/去除抗菌活性”项下所述制备样品，然后转移至薄膜过滤器后迅速过滤，并用适宜体积的稀释剂冲洗滤膜。用于确定TAMC时，将滤膜转移至TSA的表面；用于确定TYMC时，将滤膜转移至SDA的表面。TSA培养基平板计数法——每种培养基至少制备两份平板计数，结果以平均值表示。倾注平板法——先取1mL按“样品制备”、“接种与稀释”和“中和/去除抗菌活性”项下所述制备的样品加入直径为90mm的培养皿，后加入15-20mL温度不超过45℃TSA或SDA，混匀，凝固，按表1所述培养。如使用更大的培养皿，应相应增加琼脂培养基的用量。每种培养基取其计数的算术平均值，并计算原接种液的cfu值。表面涂布法——取15-20mL温度不超过45℃TSA或SDA注入直径为90mm的培养皿，凝固，制成平板。如使用更大的培养皿，应相应增加琼脂培养基的用量。干燥培养皿，可用层流柜或培养箱进行干燥。量取不少于0.1mL的按“样品的制备”、“接种与稀释”和“中和/去除抗菌活性”项下所述制备的样品，并将其铺展在培养基的表面。培养和计数方法同倾注平板法。最大概率数法（MPN）——精密度和准确度要低于薄膜过滤法和平板计数法。MPN法只适用于无其它方法可选时TAMC的计数，本法不适用于霉菌计数。若使用MPN法，按下述程序进行操作。按“样品制备”、“接种与稀释”和“中和/去除抗菌活性”项下所述，至少制备三份连续稀释10倍的供试液（即3个稀释级别）。从每一稀释级别中取出三等份的1g或1mL供试液接种于三个含9-10mL大豆酪蛋白消化肉汤试管。必要时，往培养基中加入表面活性剂或灭活剂。于30℃-35℃培养所有试管中的微生物，培养时间不超过3天。如因供试品的性质导致难以读取结果或对结果不确定，再次用相同的肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂在相同的温度下培养1-2天，读取再次培养的结果。根据表2确定每克或每毫升供试品中微生物的最大概率数。表2结果与解释在验证薄膜过滤法和平板计数法的方法适用性时，任一种试验微生物所得的平均计数值与“接种与稀释”项下所述不含供试品的对照组所得值的差异不得超过两倍。在验证MPN法的适用性时，接种液所得的计算值应在对照组结果的95%置信区间内。任一种检验方法中有一种或多种试验微生物的结果未能符合上述标准的，应选择与标准最接近的检验方法和条件来检测样品。back产品检验检验用量产品检测结果解析检验用量除另有规定，一般供试品的检验量为10g或10mL。对于气雾剂或喷雾剂，取10瓶剂量。透皮贴剂取10片。用于制成片剂、胶囊剂、注射剂等的原料药的取样量可适当减少：单位剂量含量小于或等于1mg；或每克/每毫升(对于非剂量单位显示的制剂)含量小于1mg。在此情况下，待测样品量不得少于10个剂量单位的含量或10g或10mL产品中的含量。对于取样量有限或批量特别小（如，小于1000mL或1000g）的作为原料药的物料，除另有规定外，检验量应为批量的1%。对于一批中所含的化学实体总量少于200个剂量单位的产品（如用于临床试验的样品），取样量可减至2个剂量单位，或少于100的产品取1个剂量单位。从散装物料或制剂容器中随机取样。可将足量容器内的供试品混合以取所需量的样品。产品检测薄膜过滤法使用可将滤膜转移至培养基的过滤装置。按照“计数方法适用性”项下所述制备样品。将适宜量的供试品转移分别转移至两个滤膜中，迅速过滤，用适宜的方法冲洗滤膜。将其中一个滤膜转移至大豆酪蛋白消化琼脂培养基的表面用于确定TAMC，将另一个滤膜转移至萨布罗葡萄糖琼脂培养基的表面用于确定TYMC。将含大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿置于30℃-35℃培养3-5天，含萨布罗葡萄糖琼脂的培养皿置于20℃-25℃培养5-7天。计算每克/每毫升产品所含微生物的cfu值。在检测透皮贴剂时，按“样品制备”项下所述，分别将总体积10%的供试液通过两个无菌滤膜，将其中一个滤膜转移至大豆酪蛋白消化琼脂培养基的表面用于确定TAMC，将另一个滤膜转移至萨布罗葡萄糖琼脂培养基的表面用于确定TYMC。平板计数法倾注平板法——按照“计数法的适用性”项下所述制备样品。每个稀释水平的每种培养基至少制备2个培养皿，将含大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿置于30℃-35℃培养3-5天，含萨布罗葡萄糖琼脂的培养皿置于20℃-25℃培养5-7天。选择相应稀释度的培养皿并使TAMC的菌落数少于250个且TYMC得菌落数少于50个。取每种培养基计数的算术平均值，并计算每克/每毫升产品中微生物的cfu值。表面涂布法——按照“计数法的适用性”项下所述制备样品。每个稀释水平的每种培养基至少