XXXX 丝状真菌次级代谢产物生物合成的表观遗传调控

生物工程学报ChinJBiotech2011,August25;27(8):1142−11[e-mail]©2011CJB,Allrightsreserved.Received:February16,2011;Accepted:May13,2011Supportedby:ChongqingKeyProgramofScienceandTechnologyDevelopment(No.CSTC2009AB1029),ChongqingScienceandTechnologyInnovationAbilityConstructionProgram(Nos.CSTC2009,CB1010).Correspondingauthor:ChanghuaHu.Tel:[phone];E-mail:[e-mail]重庆市科技攻关重点项目(No.CSTC2009AB1029)，重庆市创新能力建设项目(Nos.CSTC2009,CB1010)资助。综述丝状真菌次级代谢产物生物合成的表观遗传调控周锐，廖国建，胡昌华西南大学药学院现代生物医药研究所，重庆400716摘要:丝状真菌产生的次级代谢产物是新药的重要来源之一，其生物合成过程受到众多因素的调控。最近的研究表明，表观遗传对多种丝状真菌次级代谢产物的生物合成具有调控作用。DNA和组蛋白的甲基化与乙酰化修饰是目前所知的丝状真菌主要的表观遗传调控形式。通过过表达或缺失相关表观修饰基因和利用小分子表观遗传试剂改变丝状真菌染色体的修饰形式，不仅可以提高多种已知次级代谢产物产量，而且可以通过激活沉默的生物合成基因簇诱导丝状真菌产生新的未知代谢产物。丝状真菌表观遗传学正逐渐成为真菌菌株改良的新策略以及挖掘真菌次级代谢产物合成潜力的强有力手段。关键词:丝状真菌，表观遗传，DNA甲基化，组蛋白修饰，次级代谢产物，生物合成，菌株改良Epigeneticregulationofsecondarymetabolitebiosynthesisinfilamentousfungi:areviewRuiZhou,GuojianLiao,andChanghuaHuInstituteofModernBiopharmaceuticals,SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400716,ChinaAbstract:Secondarymetabolitesoffilamentousfungiareimportantsourcesofnewdrugs,andtheirbiosyntheticprocessesareregulatedbynumerousfactors.Recentstudiesindicatethatmanyfilamentousfungalsecondarymetabolitesareregulatedbyepigeneticmodifications,whichnotonlyaffectthetitersofsecondarymetabolites,butalsoactivatethecrypticgeneclusters.Thisreviewsummarizesrecentadvancesofepigeneticapplicationinfilamentousfungalsecondarymetabolitebiosynthesis,especiallythetypesoffungalepigeneticmodificationandepigeneticremodelingofthefungalsecondarymetabolism.Theapplicationofepigenetictheoryinfilamentousfungiisbecominganewstrategyforfungalstrainimprovementandapowerfulmethodtoobtainnovelnaturalproducts.Keywords:filamentousfungi,epigenetic,DNAmethylation,histonemodification,secondarymetabolite,biosynthesis,strainimprovement周锐等:丝状真菌次级代谢产物生物合成的表观遗传调控1143Journals.im.ac.cn丝状真菌具有十分丰富的次级代谢产物合成能力，很多在医药上有重要应用价值的抗生素(如青霉素和头孢菌素)、降血脂药物(如洛伐他汀)、免疫抑制剂(如环胞菌素)等都是由真菌产生的。随着真菌基因组的挖掘和次级代谢产物的生物合成研究越来越深入[1]，人们发现目前已知的丝状真菌次级代谢产物只是真菌能够合成的产物的冰山一角，比如分析构巢曲霉Aspergillusnidulans基因组，发现该菌具有产生27个聚酮类化合物，14个非核糖体多肽，1个萜类化合物以及两个吲哚生物碱的潜力，然而目前的培养条件下，仅发现数个次级代谢产物[2]。这些在实验室培养条件下未表达的生物合成基因簇被称为沉默(Cryptic)基因簇，激活这些沉默的基因簇将极大地丰富丝状真菌次级代谢产物的种类和数量，为新药开发提供重要的先导化合物。沉默的次级代谢生物合成基因簇的激活以及新次生代谢产物发现是目前真菌次级代谢产物研究的热点与难点之一[3-4]，也是微生物菌种改良的一种新方法新策略[5]。无论是真菌还是原核生物链霉菌都可以通过改变发酵培养条件[6-7]、过表达次级代谢产物生物合成途径特异性转录调控基因[8-9]，异源表达整个生物合成基因簇[10-11]得到新的化合物。近年来在链霉菌中发现，通过核糖体工程激活沉默基因簇的表达[12]，成为链霉菌次生代谢产物改构获取新化合物的有效途径，但在真菌中未见相关报道。最近的研究表明，丝状真菌的次级代谢生物合成与其基因簇所处的表观遗传状态有着密切的关系，通过表观遗传操作能大范围改变微生物的次级代谢产物谱，激活大量次级代谢产物的生物合成，这将极大丰富丝状真菌次级代谢产物的研究。本文综述了丝状真菌表观遗传研究的新进展，特别是其在真菌次生代谢生物合成和代谢产物开发中的应用。1丝状真菌中的表观遗传表观遗传是指在染色体中DNA序列不发生变化的情况下，基因表达却发生了可遗传的改变，这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定地遗传下去。表观遗传分子机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及RNA干扰等，这些变化在基因转录调控过程中扮演重要角色。表观遗传修饰在肿瘤细胞与组织中已得到普遍研究，但在真菌的形态与次生代谢的研究中刚起步。这些相关修饰中DNA甲基化和组蛋白修饰一直是表观遗传学领域的研究热点，研究表明这两类修饰与丝状真菌的多种生理状态密切相关。1.1DNA甲基化DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基转移酶(DNMTs)作用下，基因组内CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子被甲基化形成5-甲基胞嘧啶。它是一种真核生物中常见的DNA转录后碱基共价修饰过程。由于胞嘧啶5位碳原子引入了甲基，使得DNA分子构象发生了变化，影响了DNA与蛋白质分子的结合。在肿瘤细胞中，CpG岛的高甲基化通常导致抑癌基因的失活，而去甲基化可激活抑癌基因的表达。在黄曲霉Aspergillusflavus和粗糙脉孢霉Neurosporacrassa中典型的DNA甲基化水平在0.25％~1.5％之间[13-14]。在同种真菌中不同的生长时期，甲基化水平也不尽相同。比如在毛霉Phycomycesblakesleeanus的菌丝体阶段，其基因组甲基化水平约0.48％，而在其孢子阶段，其甲基化水平为2.9％[15]。虽然DNA甲基化是一种遗传性状，然而这种遗传性状却不甚稳定[16-17]。1.2组蛋白修饰组蛋白是含量丰富的染色体相关蛋白，具有两个重要的作用：作为核小体的组成部件，为DNA提供结合位点；另一个功能是它可以调控转录的起始。组蛋白的N-末端通过共价修饰作用发生甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化和磷酸化等翻译后修饰，进而形成丰富的组蛋白密码。组蛋白乙酰化是最早被发现的，也是目前研究得最深入的与转录有关的组蛋白修饰方式。组蛋白乙酰化主要发生在组蛋白H3和H4的N-端尾部比较1144ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechAugust25,2011Vol.27No.8Journals.im.ac.cn保守的赖氨酸残基上，依靠组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)维持乙酰化的平衡。在正常情况下，组蛋白赖氨酸的氨基基团存在质子化现象，这促使带正电荷的赖氨酸与带负电荷的DNA因静电效应而紧密结合；相反，组蛋白尾部赖氨酸残基被乙酰化能够使组蛋白携带的正电荷量减少，降低其与带负电荷DNA链的亲和性，促使参与转录调控的各种蛋白因子与DNA结合[18]。根据赖氨酸与DNA链的亲和力不同，而调控转录的“开”“关”，最终控制基因的表达或沉默。组蛋白甲基化是通过组蛋白甲基转移酶(Histonemethyltransferase，HMTs)和去甲基化酶(Demethylase)的相互作用，动态地调节组蛋白的甲基化状态，并且与其他功能蛋白的相互作用，来调控基因转录激活或抑制生物学过程。与组蛋白赖氨酸乙酰化促进基因表达不同，组蛋白赖氨酸甲基化对基因表达的影响比较复杂，它们中有些可以促进基因表达，有些可以抑制基因表达，取决于它所位于的残基情况。如在很多真核生物中，H3K9的甲基化通常是异染色质形成的标志，并且导致基因沉默[19]，但是在一些真菌中组蛋白甲基化是菌种正常生长的必要条件，如在烟曲霉中，敲除编码H3K9甲基化酶的基因(clrD)会降低菌落的生长半径，推迟brlA的表达从而影响分生孢子的产生[20]；在粗糙脉孢霉中，H3K36甲基化是其正常发育所必需的[21]。2表观遗传修饰与次级代谢产物生物合成研究发现真菌次级代谢生物合成基因簇常处于异染色质状态，并且位于端粒附近，其结构基因可能受表观遗传调控。丝状真菌基因组的DNA甲基化、组蛋白的乙酰化和甲基化都与次级代谢产物的生物合成密切相关，不仅影响次级代谢产物的产量，还能激活大量沉默的次级代谢产物生物合成基因簇的表达。2.1组蛋白去乙酰化与次级代谢产物生物合成表观遗传修饰对真菌次级代谢产物影响的直接证据来自通过分子遗传学手段阻断构巢曲霉的3种类型的HDACs(HdaA，HosB，HstA)。构巢曲霉能产生多种次级代谢产物，包括青霉素、norsolorinicacid和terrequinoneA。阻断hosB(真菌特异的HOS3-likeHDAC)和hstA(sirtuin的同源体)对真菌次级代谢没有显著的影响，而阻断hdaA(保守的classIIHDAC)后显著地提高norsolorinicacid和青霉素的产量。同时失去这3种HDACs的突变株的norsolorinicacid产量进一步提高，令人惊讶的是青霉素的产量却没有显著地改变[22]。在上述的所有突变株中，terrequinoneA的产量都没有明显的变化。HADCs对构巢曲霉不同次级代谢产物产量的影响可能是与这3种次级代谢产物生物合成簇在基因组上的位置有关。青霉素和norsolorinicacid的合成基因簇位于染色体Ⅵ和Ⅳ靠近端粒的100kb以内，并且其周围含有保守的DNA重复序列，这些特征是亚端粒区域的典型特征。而terraquinoneA的合成簇位于染色体Ⅴ的远端，离端粒的距离约700kb。与构巢曲霉类似，在烟曲霉A.fumigatus中敲除hdaA也可提高多种次级代谢产物的产量，对烟曲霉14个非核糖体肽合成酶(NRPS)进行RT-PCR分析发现，HdaA对9个NRPS有调控作用，对包括制霉菌素在内的4个NRPS存在正