《现代生物技术》作业

1/9《现代生物技术》作业1、生物技术（biotechnology）最初由谁提出？其含义是什么？1982年国际织对生物技术是如何重新定义的？答：（1）生物技术（biotechnology）最初由一位匈牙利工程师KarlEreky于1917年提出。（2）KarlEreky当时提出这一名词的涵义是指用用甜菜作为饲料进行大规模养猪，即利用生物原料变为产品。（3）1982年国际组织对生物技术重新定义为：生物技术是应用自然科学及工程科学的原理，依靠微生物、动物、植物作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。2、为什么说DNA重组技术改变了生物技术的性质？答：DNA重组技术的发展改变了生物技术的性质，基因工程可以直接“创造”一个高产菌种，可以使得一些生物或真核细胞直接成为生成胰岛素、生长素、干扰素等蛋白质药物的“工厂”，使得动植物成为生产新的或被修饰的基因产物的“生物反应器”。3、生物技术的发展趋势主要体现在哪些方面？答：现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几方面：①基因操作技术日新月异，不断完善。②基因工程药物和疫苗研究与开发突飞猛进。③转基因动物和植物取得重大突破。④阐明生物体（目前主要是人类、水稻等）基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向。⑤基因治疗、细胞核移植克隆、胚胎干细胞等技术取得重大研究发展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。⑥蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。⑦信息技术的飞速发展渗透到生命科学领域中，形成了引人注目、用途广泛的生物信息学。4、简要说明现代生物技术商业化的特点。答：现代生物技术商业化的特点体现在以下几个方面：①典型的技术密集型产业。②市场迅速扩张。③世界各国政府高度重视。④生物技术制药是现代生物技术产业的支柱。⑤现代生物技术产品不断增加。⑥经营现代生物技术产品的公司竞争激烈。⑦各生物技术公司的研究目标日趋集中，生产的产品更加专一。⑧医学生物技术产业化进程最快。5、DNA重组技术包括哪些基本步骤？2/9答：一个典型的DNA重组试验通常包括以下几个步骤：①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶解连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。②将这个重组的DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化(transformation)。③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达。6、简述DNA分子的基本结构和功能。答：（1）DNA分子的基本结构：DNA分子是一种双链螺旋状分子。DNA链的基本单位是脱氧核糖核苷酸，它由碱基、脱氧核糖和磷酸基团相连。DNA链上的核苷酸可多可少，它们通过一个脱氧核糖的3’羟基与另一个相邻的核苷酸的5’磷酸基团之间形成磷酸二酯键而串联起来。由于碱基遵循互补的原则，所以一条DNA链上的核苷酸顺序决定了与它配对的另一条DNA链上的相对应的核苷酸顺序，后者也称为互补核苷酸链。碱基包括4种：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)，A只与T配对，C只与G配对。在DNA复制的过程中，每一条已经存在的DNA链都可以作为模板合成新链，链上的脱氧核糖的3’羟基通过酶促反应与要掺入的核苷酸的5’磷酸形成磷酸二酯键，从而使脱氧核糖核苷酸依次加入，而且新合成的DNA链仍然遵循碱基互补配对原则，且两条链是反向平行的。（2）DNA分子的基本功能：生物体的结构和生化功能是由其体内的DNA中所包含的遗传信息决定的。作为遗传信息的基本单位，基因所携带的信息实际上是由核苷酸的排列顺序决定的，编码蛋白质的基因要通过两个生理过程才能解码。第一，编码蛋白质的基因（也称结构基因）作为模板产生一种RNA分子，即信使RNA(messengerRNA,mRNA)，这个过程称为转录(transcription)；第二，单个的mRNA分子在其他的细胞组分（包括核糖体、tRNA和酶）的帮助下合成蛋白质分子，这个过程称为翻译(translation)。7、简要说明Ⅱ型限制性内切酶有哪些特点及用途？答：（1）特点：限制性内切酶所结合的被切割的DNA序列称为识别序列或识别位点。大多数类型Ⅱ限制性内切酶的识别序列是回文序列。有些限制性内切酶切割DNA后产生5’磷酸突出的末端，有些则产生3’羟基突出的末端，它们统称为黏性末端；还有一些在切割两条链时会产生两端平整的（平末端）的DNA分子。限制性内切酶的识别位点可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对。由于限制性内切酶的识别位点在DNA分子中出现的频率不同，即识别位点序列短，限制性内切酶就会更频繁地切割DNA分子。（2）用途：①不同的限制性内切酶切割同一DNA分子，电泳，制出该DNA的物理图谱。②切割两条不同的DNA样品后产生相同的黏性末端，混在一起产生一个新的嵌合DNA分子。③用限制性内切酶处理DNA后，会产生多个DNA片段，连接进克隆载体后，形成多个不同的重组DNA分子。8、目前常用哪些物质作为克隆载体？答：目前常作为克隆载体的物质有以下几种：3/9（1）质粒(plasmid)，包括质粒载体pBR322和质粒载体pUC19。质粒载体最大可以克隆DNA片段一般在10kb左右。（2）噬菌体。它的局限性在于重组噬菌体DNA太大（＞52kb）或太小（＜38kb）都无法有效地装进噬菌体头部。（3）柯斯质粒，可携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制存在，适用于作基因簇和大基因的克隆。（4）YAC质粒（酵母人工染色体yeastartificialchromosome的缩写），是目前能容纳最大外源DNA片段的载体。9、pBR322质粒载体命名、结构、特点是什么？答：（1）命名：小写的p代表质粒，BR代表研究出这个质粒的研究者Bolivar和Rogigerus，322是与这两个科学家有关的数字编号。（2）结构：pBR322大小为4363bp，含有两个抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；还有单一的BamHI、HindⅢ和SalI是识别位点，这三个位点都在四环素抗性基因内；另一个单一的PstI识别位点在氨苄青霉素抗性基因内。pBR322带有一个复制起始位点，它可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能。（3）特点：pBR322在大肠杆菌里以高拷贝数存在。10、简述如何进行原核细胞的转化与筛选？答：（1）转化：把纯化的DNA导入细菌细胞过程称为转化。原核细胞的转化过程就是一个导入外源基因的过程。对于大肠杆菌来说，人们一般采用先用冰冷的CaCl2处理，然后置于42℃热激90s的方法帮助其吸收外源DNA，这种方法的最大转化频率为10-13，其效率是每微克DNA转化107-108个细胞。DNA分子还可以通过电穿孔(electroporation)的方法转入细菌。简单地说，就是把宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉场冲在细胞壁上打孔，DNA分子随即进入细胞。电穿孔的方法也因菌而异，对于大肠杆菌来说，一般是50mL细胞用25μF、2.5kV和200Ω的脉冲处理4.6ms，其转化效率可以达到小质粒每微克DNA转化109个细胞，大质粒（＞100kb）也可以达到每微克DNA转化106个细胞.（2）帅选：转化之后，就要对含有外源DNA的重组质粒进行鉴定。以外源DNA插入到pBR322的BamHI位点中为例，可以通过以下步骤来鉴别：先将转化的细胞涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，只有那些带有完整的pBR322质粒或是插入有外源DNA片段的pBR322质粒的细胞可以在培养基上生长，没有转化的细胞就会被氨苄青霉素杀死。第二步是把含有氨苄青霉素的培养基上的克隆转移到含有四环素培养基上，如果在含有四环素的平板上生长，该克隆就带有自身环化的pBR322，因为这些细胞对两种抗生素都有抗性，而那些只在氨苄青霉素平板上生长，却在四环素平板上不能生长的克隆就是带有外源DNA的重组质粒的克隆。重复第二步筛选步骤，就可以较为确定地筛选出那些带有特异插入的外源DNA的重组质粒。11、如何构建原核生物的基因文库？答：首先要用限制性内切酶对总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片段克隆进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。4/912、通过哪些方法从基因文库中筛选目的基因？答：构建了文库以后，就需要鉴定出文库中带有目的序列的克隆。有以下三种通用的鉴定方法。①DNA杂交筛选：用标记的DNA探针进行DNA杂交；②通过免疫反应筛选：用抗体对蛋白质产物进行免疫反应；③通过酶活性筛选：对蛋白质的活性进行鉴定。13、一般用哪些方法可获得真核生物的目的基因？答：可获得真核生物的目的基因的方法有：（1）cDNA方法。（2）DNA的化学合成。（3）利用PCR法获得基因，其中，除了普通的PCR方法外，还要用到一些改进的PCR方法，包括：①逆转录PCR；②锚定PCR；③反向PCR。14、利用原核生物构建一个较好的表达载体须从哪几个方面考虑？答：（1）转录启动子和终止子序列的特点；（2）核糖体结合位点的强弱；（3）基因拷贝数，及其是存在于质粒中还是整合到宿主基因组中；（4）合成的外源蛋白在细胞中的定位；（5）宿主的翻译效率；（6）克隆基因所表达的蛋白质在宿主中的自身稳定性。15、一般原核生物的基因是如何转录的？答：第一步──起始：RNA聚合酶在第一类信号的指引下结合于染色体DNA的一段特定段序列（即启动子区）上。第二步──延伸：转录起始后，RNA聚合酶沿着DNA链一直向下移动，同时合成RNA链。第三步──终止：RNA链延伸直至到达一特定的终止序列或终止结构（终止子）时就停止了。16、一般原核生物的基因是如何翻译的？答：首先，在紧靠起始密码子（通常为AUG）上游的SD序列可以与16SrRNA的3’端核苷酸序列形成互补，从而帮助核糖体结合到mRNA的正确位置上。然后，完整的RNA分子的密码子所编码的氨基酸按顺序连接起来，直至遇到终止密码子（UAA，UAG，UGA），翻译过程停止，合成好的蛋白质分子就释放出来。17、如何运用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子？答：第一，用HindⅢ将pBR316质粒中四环素抗性基因启动子内的单一HindⅢ位点切开；第二，线性质粒用S1核酸酶处理切去单链或用E.coliDNA聚合酶处理聚合补平，产生平末端；5/9第三，由于pBR316质粒不含EcoRI位点，因此在平末端处加入一段6bp长的EcoRI接头(EcoRIlinker)，以产生EcoRI位点，并破坏启动子。18、目前在原核系统中使用最普遍的强启动子有哪些，分别由哪些结构组成？答：（1）种类：目前在原核系统中使用最普遍的强启动子主要有5种，包括大肠杆菌lac启动子，大肠杆菌的trp操纵子的启动子，将lac的-10区和trp的-35区融合起来的tac12启动子，λ噬菌体中的左向启动子PL，T7噬菌体基因10的启动子。（2）结构：①lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，它由启动子、活化蛋白（AP）结合位点、操纵基因及lacZ。②trp启动子来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子，它由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构基因组成。③tac启动子是来源于lac和trp的一组非常强的杂合启动子，比lac和trp的启动子都强得多。tacI由trpI的-35区域和lacUV5的-20区域构成；tacⅡ是由trp的-35区域（一段合成的包括Pribnow盒在内的46bpDNA片段）和lac操纵基因构成；tac12是由trp的-35区域和lac的-10区域构成。④PL启动子是指λ噬菌体左向转录启动子，它控制λ噬菌体左向操纵子从基因N到int的早期转录，它受cI所编码的阻遏蛋白的调控。19、原核生物的表达蛋白纯化方法选择的基本原则有哪些？答：原核生物的表达蛋白纯化方法选择的基本原则有以下几点：①针对不同的产物表达形式采取不同的策略；②针对不同性质的蛋白质选用不同层析类型；③多种分离纯化技术的综合运用；④选择合适的分离纯化材料；⑤分离纯化