“生物检验检疫”课程实验教案授课人：陈勇实验一：病料的采

“生物检验检疫”课程实验教案授课人：陈勇实验一：病料的采集及病原菌的分离和培养方法(一)病料采集学习目的：了解常见病料的采集部位，掌握病料采集注意事项，学会进行常见病料采集。一：血液的采集根据检验项目及需要血液料的多少，可以选用静脉采血或心脏采血。（一）静脉采血鱼是尾静脉；马，牛，羊犬，猫一般多在颈静脉；成年猪在耳静脉；6个月以内的猪在前腔静脉；禽在翅静脉采血。前腔静脉的采血术是：猪仰卧，拉直两前肢使两前肢向后与体中线平行。手持针管，针头斜向后内方与地面呈60度角，向右侧或左侧胸前窝刺入，进针2~3厘米即可抽出血液。术后局部常规消毒。（二）末梢或小静脉采血马牛可在耳尖部采血：局部剪毛，酒精消毒，用18号针头刺入1厘米左右，血液即可流出。猪羊兔等可穿刺耳边缘小静脉。（三）心脏采血禽或试验小动物需要血量较多时可采用本法。禽的采血：右侧卧保定，左侧胸部向上，取一个10毫升注射器，接上长约5厘米的针头，从胸骨脊前端至背部下凹处连接线的中点，垂直或稍向前内方刺入2~3厘米即可。兔或豚鼠等的采血：在胸部左侧触及心脏跳动处垂直刺入，边刺边抽注射器内塞，将血取出。二：其他病料采集（一）乳汁的采集乳头及术者的手用新洁尔灭消毒，将最初挤出的乳汁弃去，采10~20毫升左右乳汁与灭菌容器中。（二）脓汁，鼻液，水疱液，水肿液的采集用灭菌棉拭子蘸取脓汁于灭菌试管中。未破的脓肿，水疱液，水肿液等无菌注射器吸取，注入无菌容器中。尸体剖检后胸水，心包液，关节囊液等可用灭菌吸管吸取，置于灭菌容器中（三）粪便的采集以清洁玻棒挑取新鲜粪便少许（约1克）或用棉拭子自直肠内掏取，置于小瓶内。（四）肠管的采集用线扎紧一段肠管（约6厘米）两端，结外剪下置于灭菌容器中。（五）胆汁的采集整个胆囊置于塑料袋中或以无菌注射器吸取胆汁于灭菌容器中。（六）脑和脊髓的采集采取脑，脊髓于适当保存液中，或将整个头割下，包于锓过0.1%升汞的纱布中，于木箱中送检。（七）实质脏器的采集选择典型病变连同一部分正常组织，切下一，二块，每块不小于4厘米*2厘米*2厘米。（八）鱼体表、鳃表面的采集(二)病原菌的分离和培养一、实验目的：（1）掌握无菌操作的概念和基本操作技术。（2）了解细菌常用培养基以及培养条件（3）了解平板划线分离菌种的原理和操作要点二、实验原理：微生物的接种技术是微生物学研究中的一项最基本的操作技术。在微生物学的科学试验及发酵生产中，都要把一种微生物移接到另一灭过菌的新鲜培养基中，使其生长繁殖并获得代谢产物。根据不同的接种方法，如斜面接种、液体接种、平板接种、穿刺接种等。接种方法不同，常有不同的接种工具，如接种针、接种环、接种钩、滴管、移液管、涂布器等。接种的菌种都是纯培养的微生物，为了解保纯种不被杂种菌污染，在接种过程中必须进行严格的无菌操作。三、实验材料：烧杯、玻璃棒、天平、电炉、培养基、蒸馏水、接种环、培养皿（12个）、试管（20支）、高压灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、温箱四、实验步骤：1、配制培养基：用天平称取琼脂培养基粉末45克，加入100毫升的蒸馏水，用电炉加热直至培养基彻底溶解。2、分装试管：将溶解的培养基分装入试管，且分装入的培养基应不超过试管高度的三分之一，塞上木塞。3、灭菌：将装入培养基的试管、培养基与培养皿用报纸包扎好，一起放入高压灭菌锅，126度灭菌15分钟，等冷却后将试管斜放，制成斜面（斜面长度不超过试管长的一半）。4、制平板培养基：将灭完菌的培养皿与培养基移至无菌操作台，在无菌条件下制成平板培养基，待用。5、取菌种：（1）每个试管中放入1毫升的生理盐水。分成三组。（2）用接种环取鱼鳃、身体与尾部的细菌，分别放于1号试管中。（3）1号试管取一半带菌液体放入2号试管中，振荡，再取一半带菌液体加入3号试管，振荡，取一半液体加入4号试管，振荡。6、分离细菌：（1）在无菌条件下操作，点燃酒精灯后，左手持皿，底朝下盖朝上，以无名指和小指托底，用拇指、食指和中指将皿盖揭开成20左右的角度（角度愈小愈好，以免空气中细菌进入皿中将培养基污染）。（2）右手持接种环于酒精灯上灼烧灭菌，待冷，取带菌液体于平板培养基上划线分离培养。（3）划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用标签做好标记，倒置，待培养。7、培养细菌：将培养皿放入37C温箱中培养。五、实验结果：培养出多个单菌落。实验二细菌的形态学鉴定方法(一)细菌的形态学观察一、实验目的：了解细菌的个体形态和菌落培养特征。二、实验原理：（一）菌体形态观察细菌个体微小，观察个体大小、外形、排列、特殊结构时，一般借助普通光学显微镜。细菌的基本形态可分为三类：球菌、杆菌和螺旋菌。1、球菌菌体呈球形。按其分裂的方向和分裂后排列情况不同，可分为双球菌、链球菌、葡萄球菌等。双球菌在一个平面上分裂，分裂后菌体成对排列，如脑膜炎双球菌、肺炎链球菌；链球菌连续不断地在一个平面上分裂，呈链状排列，如化脓链球菌；葡萄球菌是在多个不同角度平面上做不规则分裂，分裂后菌体堆积成葡萄串状，如金黄色葡萄球菌。2、杆菌菌体呈杆状或近似杆状。各种杆菌长短粗细差别很大，短的几乎呈球形，长的可呈丝状，杆菌的两端形状在鉴定细菌时具有一定的意义。大多数杆菌两端钝圆，如大肠杆菌；有的平切，如炭疽杆菌；有的尖细，如梭状杆菌；有的末端膨大似棒状，如百喉杆菌；有的呈球杆形，如多杀性巴氏杆菌。杆菌大多数呈散在排列，也有的呈链状排列，如炭疽杆菌，有些形成侧枝称分枝杆菌，如结核分枝杆菌。3、螺旋菌菌体弯曲。根据其弯曲的程度和螺旋数，又可分为孤菌、螺菌和弯杆菌。孤菌的菌体只有一个弯曲呈孤状，如霍乱孤菌；螺菌的菌体有两个以上弯曲呈螺旋形，如鼠咬症螺菌；弯杆菌呈孤形、螺旋形或S形，如结肠空肠弯杆菌。某些细菌除具有基本结构外，还具有某些特殊结构，如荚膜、鞭毛、芽孢等，通过特殊染色法加以观察，对鉴别细菌的种类具有一定意义。（二）菌落性状观察各种细菌在培养基上生长时，常表现出一定的特征，如在特殊培养基内所表现的发育情况，菌落的形态和色素的产生等。这对于细菌菌属的鉴别，具有重要的意义。细菌在固体培养基上培养时，由单个菌细胞固定一点而大量繁殖，经过一定时间（一般为18~24小时）的孵育，在培养基表面出现肉眼可见的细菌集团，这种集团称为菌落。每一种细菌有它一定的菌落形态，其大小、隆起或扁平、表面的性质、光泽、色素的产生、边缘的形状等各有特点，所以，菌落的形态在识别细菌上有一定的意义。例如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色之圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平、干燥、边缘不整齐的波纹状菌落，用放大镜观察时，它们呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌形成圆形、湿润、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌形成细小露珠状菌落。观察菌落形态特征时，通常先用肉眼观察，再用放大镜检查，必要时用显微镜检查。观察的内容和方法主要有以下几个方面：（1）大小菌落的大小以毫米来表示，一般不足1毫米者为露滴状菌落，1~2毫米者为小菌落，2~4毫米者为中等大菌落，4~6毫米或更大者称为大菌落或巨大菌落。（2）形状菌落的外形有圆形、不整形、树根形、葡萄叶形等。（3）边缘边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状及卷发状等。（4）表面性状观察其是否平滑或粗糙，是否有皱仄状，蜗旋状，甚至有子菌落等。（5）隆起度有隆起、轻度隆起、中央隆起；反之，略有扁平、陷凹或堤状等。（6）颜色及透明度有无色、灰白色及产生各种色素者；有无光泽、透明、半透明及不透明等区别。（7）硬度有黏液状、脂状、干燥或湿润等。三、实验器材：解剖镜四、实验结果：观察多种多个单菌落。(二)细菌的染色观察一、实验原理：（1）简单染色：只用一种染料使细菌染色，该法可用于观察细菌的形态，难于辨别细菌的细胞结构。（2）革兰氏染色：G+和G-其细胞壁的结构和成分不同，G-菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，并且肽聚糖层较薄、交联度低，在使用乙醇或丙酮脱色时，因类脂质溶解增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌被脱色，再经石炭酸复红复染后即成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。（3）芽孢染色：细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着色又难以脱色。通常，芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色完毕，用自来水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水冲洗掉，而进入芽孢中的孔雀绿却难以溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染，使菌体和芽孢呈现不同的颜色。二、实验准备：染色剂的配置：1、碱性美蓝染色液甲液：美蓝0.3克95%酒精30毫升乙液：0.01%苛性钾溶液100毫升先配美蓝饱和液（甲液），将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，越夜后用滤纸过滤即成。新鲜配制的美蓝染色不好，陈旧的染色好。2、革兰氏染色液（1）草酸铵结晶紫溶液甲液：结晶紫2克95%酒精20毫升乙液：草酸铵0.8克蒸馏水80毫升将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀，然后将完全溶解的乙液与甲液混合即成。（2）卢戈氏碘液碘1克、碘化钾2克，蒸馏水300毫升。将碘化钾放入研钵中，加入少量蒸馏水，使其溶解，在放入已磨散的碘片，徐徐加水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入，再装于瓶中。（3）稀释石炭酸复红溶液取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10克溶于95%酒精100毫升中）1毫升和5%石炭酸水溶液9毫升混合，即成稀释石炭酸复红溶液。3、瑞氏染色液取瑞氏染料0.1克，纯中性甘油1毫升，在研钵中混合研磨，再加甲醇60毫升，使其溶解，装入中性瓶中越夜，次日过滤，盛于棕色瓶中，保存于暗处。保存越久，染色越好。4、姬姆萨染色液取姬姆萨染料0.6克，加入甘油50毫升，置于55~60C水浴箱中，2小时后加入甲醇50毫升，静置1天以上，过滤后即可使用。三、实验步骤：（一）、一般染色1、美蓝染色法经涂片、干燥、固定后，滴加美蓝于涂片上，使之覆盖涂面，染色2~3分钟，用水冲洗，晾干或用吸水纸轻压吸干后即可镜检，菌体呈蓝色。2、革兰氏染色法经涂片、干燥、固定后滴加适量草酸铵结晶紫液于涂面上（以盖满细菌涂面为度），初染1分钟后水洗。再滴加卢戈氏碘液覆盖1分钟，水洗（此步水洗可省略）。加95%酒精脱色约30秒至1分钟，立即水洗。最后滴加石炭酸复红稀释液复染1分钟，水洗，自干或用吸水纸吸干后镜检。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。（二）、特殊染色法对细菌的荚膜、芽孢、鞭毛等特殊结构，因其不易着色，通常采用特殊的荚膜染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法来进行染色。1、荚膜染色法（1）希司氏荚膜染色法细菌涂片，甲醇固定后，用一小块滤纸片覆盖于涂膜上，滴加结晶紫染液，并置于火焰上略加热至发生蒸汽为止（约近1分钟），倾去染液，除去滤纸片，再用20%硫酸铜溶液冲洗，待干后镜检。菌体呈紫色，荚膜呈淡蓝色。（2）骆氏美蓝荚膜染色法细菌涂片、固定后，用久贮的骆氏美蓝液染色1~2分钟，水洗、干燥后镜检。菌体呈蓝色，荚膜呈淡红色。2、芽孢染色法固定后的涂膜上滴加5%孔雀绿液微微加热染色0.5~1分钟，到发生蒸汽为止，待冷后水洗，再滴加沙黄液复染0.5分钟，水洗、干燥后镜检。芽孢成绿色，菌体呈淡红色。3、鞭毛染色法取鞭毛菌液，干燥后滴加户田氏染色液，染色约0.5~5分钟，水洗、干燥后镜检。菌体呈深红色，鞭毛呈淡红色。实验三细菌的生化特性鉴定细菌的生理生化试验是菌种鉴定的重要依据，通过细菌的生理生化反应了解细菌在不同基质中的各种代谢途径和产生不同的代谢产物及在菌种鉴定中的重要性，本实验选做其中的9个实验，包括硫化氢试验、靛基质试验（吲哚实验）、糖发酵试验、乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）、甲基红试验（M.R试验）、尿素酶试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验。一、硫化氢试验1、实验目的：（1）了解硫化氢产生试验的用途及原理。（2）学习硫化氢产生试验的操作技术。2、实验原理：某些细菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱