不同pH处理对菹草Cr6+毒性效应的影响

_____________________________________________论文资助来源：江苏高校优势学科建设工程资助项目(No.164320H106).第一作者简介：黄敏，1989年生，硕士研究生，E-mail:[e-mail].通讯作者：施国新，教授，博士生导师，主要从事植物学的教学与研究。E-mail:[e-mail].不同pH处理对菹草（PotamogetoncrispusL.）Cr6+毒性效应的影响黄敏，施国新**，夏海威，吴娟，乔绪强，汪鹏合，陈霖（南京师范大学生命科学学院江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京210023）摘要：本文研究了Cr6+胁迫及不同pH处理下Cr6+胁迫菹草无菌苗元素含量、光合色素、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、抗氧化酶、脯氨酸（Pro）及多胺（PAs）含量的变化，以探讨不同pH处理影响水生植物Cr6+毒害效应的机制。结果显示：(1)Cr6+胁迫使菹草体内铬含量极显著增加，并造成明显的矿质营养失衡，主要表现为促进Zn、B的吸收，抑制Ca、P、Mg元素的吸收。偏酸性pH处理加剧了菹草对铬的蓄积，而pH7.0处理时Cr6+胁迫所造成的矿质元素失衡有所减弱；(2)Cr6+胁迫下，ROS和MDA含量显著上升，光合色素含量降低，而pH6.0~pH8.0处理延缓了菹草的失绿症状，促进了光合色素的合成；(3)Cr6+胁迫下超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性提高，在pH6.0和pH7.0处理组其诱导程度最小；(4)Cr6+胁迫引起脯氨酸大量积累，pH6.0、pH7.0处理进一步促进其积累；(5)Cr6+胁迫影响多胺代谢，表现为促进腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）积累，提高f(Spd+Spm)/Put比值。pH4.0、pH5.0处理使Put含量显著提高，而pH6.0、pH7.0处理则促进Spd含量及f(Spd+Spm)/Put比值上升。Spm含量总体趋势为随pH值升高而逐步上升，仅在pH4.0和pH5.0处理组中低于对照组，而pH8.0、pH9.0处理能促进Spm含量积累。以上结果表明，pH条件可通过影响菹草对铬及营养元素的积累、抗氧化酶、脯氨酸、多胺代谢等生理生化过程，导致铬毒性效应差异。在pH6.0~7.0范围内，菹草能调节抗氧化酶系统，有效清除体内ROS，提高机体中脯氨酸、多胺含量及f(Spd+Spm)/Put比值，减轻膜系统脂质过氧化，维持机体内矿质元素平衡，致使毒性效应达最小程度。关键字：菹草；Cr6+胁迫；pH值；元素含量；脯氨酸；多胺TheToxicologicalEffectsofCr6+onPotamogetoncrispusL.atDifferentpHValuesHUANGMin,SHIGuoxin*,XIAHaiwei,WUJuan,QIAOXuqiang,WANGPenghe,CHENLin(CollegeofLifeScience，NanjingNormalUniversity，JiangsuKeyLabofBiodiversityandBiotechnology，Nanjing210023，China)Abstract:SterileseedlingsofPotamogetoncrispuswereculturedbytissueculturetechniquewhichwasusedasexperimentalmaterial.Inthisstudy,weinvestigatedcontentsofelement,photosyntheticpigments,reactiveoxygenspecies(ROS),malondialdehyde(MDA)andproline,polyaminesaswellasactivitiesofantioxidantenzymesinCr6+-treatedP.crispusatdifferentpHlevelssoastoapproachthephysiologicalandbiochemicalmechanismsofpHvalueinaffectingCr6+toxicityofaquaticplants.Theresultsindicatedthat,(1)Cr6+stresssignificantlyincreasedCrcontentandresultedinseriousimbalanceofnutrientelementsincludingtheenhancementofZnandBaswellastheinhibitoryofCa,P,andMg.AcidicconditionsenhancedtheaccumulationofCrwhilepH7.0treatmenthelpedP.crispusmaintainthebalanceofnutrientelements;(2)UnderCr6+stress,contentsofreactiveoxygenspecies(ROS)andMDAincreasedwhilethecontentsofphotosyntheticpigmentsreduced.Moreover,pH6.0,pH7.0andpH8.0treatmentscouldretardthechlorosisandpromotedthebiosynthesisofphotosyntheticpigments;(3)Activitiesofsuperoxidedismutase(SOD)andcatalase(CAT)wereimprovedandtheimprovementcouldbeenhancedwhenthepHvaluewas4.0,5.0,9.0;However,activityofperoxides(POD)wasinhibitedunderCr6+stressandfutherdecreasedwiththeincreaseofpHvalue;(4)InresponsetoCr6+stress,plantsshowedsharpincreaseinproinecontentespeciallywhenthepHwas6.0or7.0;(5)ChangesofpolyaminecontentsindicatedthatCr6+stressdisturbedmetabolicbalanceofpolyaminesbypromotingthelevelsofputrescine(Put),spermidine(Spd),spermine(Spm)andfree(Spd+Spm)/Putratio.Inaddition,anenhancedlevelofPutwasnotedinpH4.0、pH5.0treatmentswhiletheincreaseofSpdandfree(Spd+Spm)/PutratiowereenhancedinpH6.0、pH7.0treatments;ForSpmcontent,itgenerallyincreasedwithpHvalueanditwaslowerthanthecontrolgroupwhenthepHvaluewas4.0or5.0.OurresultsdemonstratedthatresistanceofP.crispustoCr6+stresscouldbeenhancedbyreducingtheexcessiveaccumulationofCr,promotingphotosyntheticpigments,removingROSefficiently,maintainingthebalanceofnutrientelementsandkeepinghighlevelsofproine,polyaminesaswellasfree(Spd+Spm)/PutratiowhenpHvaluewaswithintherangefrom6.0to7.0.Keywords:PotamogetonCrispusL.;Cr6+stress;pHvalues;elementcontents;proline;polyamine铬是发展国防、化工、农业等不可缺少的战略物资，被广泛应用于冶金、电镀、印染、印刷、农药化肥等领域[1]。但它又是剧毒且迁移性大的重金属元素，易随工农业废弃物进入环境，造成严重的水体铬污染，据统计我国每年排放铬渣近60万吨[2]。在较低水平下铬(VI)即对植物产生毒害作用，包括破坏营养和水分平衡[3]、干扰色素合成、诱导线粒体电子传递失活[4]、改变抗氧化酶活性、引起ROS代谢失调[5]，破坏叶绿体和细胞膜的超微结构、对蛋白质及DNA等生物大分子造成损伤[6]，且通过食物链而对人、畜健康构成巨大威胁[7]。作为重要的环境因素，环境pH值会影响植物细胞内的多种代谢活动。据有关报道，在正常生长发育的植物细胞内存在精确的pH调控，细胞的代谢活动、DNA复制、细胞分裂等均随pH变化而被激活或抑制[8]。不适宜的pH值环境会造成植物营养元素缺乏，从而引起植株发育矮小，根系不发达等症状[9~11]。目前关于植物pH变化调控及其生理学意义已受到关注，但不同pH值对植物重金属胁迫影响的研究相对较少，尤其是对水生植物而言。研究表明，pH值能对生物体结合重金属的活性位点产生显著的影响，不同重金属离子所要求的最佳吸附pH也不同[12,13]。马尾藻对cd吸附的最佳pH为4.5，而石莼对cd吸附的最佳pH为8.0[14]。陈利等研究也发现Cd2+水稻幼苗的毒害直接受pH值影响，且在pH6.0时水稻所受毒害程度较弱[15]。本文以沉水植物菹草无菌苗为实验材料，研究了不同pH条件下，Cr6+胁迫对菹草铬元素及矿质元素积累、光合色素、ROS水平及MDA、抗氧化酶系统、脯氨酸、多胺含量等生理指标的影响，分析了菹草体内各生理指标在铬毒害效应中的差异，以期为植物的抗性原理增添素材，同时为重金属污染水域的治理提供一定的理论参考。1材料和方法1.1供试材料菹草（PotamogetoncrispusL.），眼子菜科（Potamogetonaceae）眼子菜属（Potamogeton），多年水生草本植物。于2012年4月采自南京市琵琶湖水域。以幼嫩菹草带节间的茎段培养的无菌苗为研究对象。1.2实验方法1.2.1菹草无菌苗的培养取生长旺盛的菹草去除根和叶，用清水冲洗干净。依次经过5%的H2O215min、10%的NaClO30s消毒，然后用无菌水清洗6遍后，将其剪成1cm左右。辨认形态学上端后，插入到添加6-BA（2.0mg/L）和IBA（0.5mg/L）MS培养基中诱导芽分化。待茎间侧芽长至2cm之时，转入添加6-BA（1.0mg/L）的继代培养基中培养。在继代培养基中培养一个月后，转入灭菌的1/10Hongland培养液中生根培养。生长期均在培养室中完成，光照周期为16h:8h（L:D），光照强度为240-300μmolm-2s-1，光暗温度为25℃：18℃（L：D）。1.2.2菹草无菌苗Cr6+处理选取大小相似，生长状况一致的菹草无菌苗，将挑选好的植株分成3组进行处理。CK对照组：用1/10Hoagland营养液培养；Cr6+胁迫组：用含0.05mmol/LCr6+的1/10Hoagland营养液培养；pH处理组：用含0.05mmol/LCr6+的1/10Hoagland营养液培养，且将pH分别调为pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共6个pH水平（使用0.1mmol/LHCl或0.1mmol/LNaOH溶液）。实验条件与培养菹草无菌苗时的条件一致，试验过程中每1d调一次pH，每2d换一次培养液。实验处理8d后，进行生理指标测定，实验重复三次。Cr6+供试药品为重铬酸钾(K2Cr207)。1.2.3元素含量的测定称取0.6g鲜重，硝酸和高氯酸消