不同测定方法对饲料粗蛋白测定结果影响的研究

不同测定方法对饲料粗蛋白测定结果影响的研究扬州大学动物科学与技术学院/王潍波摘要试验采用国标法、凯氏定氮法、强碱直接蒸馏法、双氧水测定法对鱼粉、玉米蛋白、豆粕三种饲料原料的粗蛋白含量进行分析测定，旨在探讨4种方法的测定误差，以期找到最好的测定方法。试验结果表明，4种方法的测定结果差异不显著（P0.05）,均可用于粗蛋白的测定；其中强碱直接蒸馏法测定是最好的，可以节省试剂，减少实验经费，在一般饲料质量检测中可进行推广。关键词测定方法；饲料；粗蛋白；影响在传统的饲料粗蛋白测定方法即国标法中，由于操作方法和实验仪器的原因，样本经消化、蒸馏、滴定诸道工序，易造成误差，费时费电。目前生产中常用的方法有国标法、凯氏定氮仪法、强碱直接蒸馏法、双氧水法、双缩脲法等。现有研究资料表明，后四种方法均优于国标法，但各种方法都各有优缺点，本研究以几种不同的蛋白质测定方法测定了一些有代表性的饲料原料，通过比较，以期找到最好的测定方法。1试验材料1.1检样的采集、制备直接在生产单位采集三种有代表性的原料检样：鱼粉、玉米蛋白粉、豆粕，分别采用四分法将检样缩至500g，粉碎后并全部通过40目筛，装于密闭容器中，防止试样成分变化或变质。1.2主要试剂硫酸：化学纯，含量为98%，无氮；混合催化剂：0.4gCuSO4，6gK2SO4或Na2SO4，均为化学纯，磨碎混匀；NaOH：40%水溶液，化学纯；硼酸：2%水溶液，化学纯；混合指示剂：甲基红、0.1%乙醇溶液、溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两者等体积混合，在阴凉处保存期为3个月；0.1moL/LHCL标准溶液：将8.3mL分析纯HCL注入1000mL蒸馏水中；0.02moL/LHCL标准溶液：将1.67mL分析纯HCL注入1000mL蒸馏水中；蔗糖：分析纯；硫酸铵：分析纯，干燥；硼酸吸收液；双氧水：分析纯，含量为30%；酒石酸钾钠：分析纯；碘化钾：分析纯；蛋白质标准溶液(4g/dL)购自北京中生生物工程高技术公司。1.3主要仪器实验用样品粉碎机或研钵；40目分析筛；分析天平：感量0.0001g；消煮炉或电炉；酸式滴定管；凯氏蒸馏装置；凯氏定氮仪；电热恒温水浴锅；玻璃烧杯；25mL具塞玻璃试管；25mL、1000mL容量瓶；1mL、5mL、10mL吸量管；100mL量筒；托盘天平等。2测粗蛋白的不同的分析方法2.1国标法2.1.1原理国标法测定试样中含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵，加入碱进行蒸馏使NH3逸出，用硼酸吸收后，再用盐酸滴定，测出含氮量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白的含量。2.1.2试剂硫酸：化学纯，含量为98%，无氮；混合催化剂：0.4gCuSO4，6gK2SO4或Na2SO4均为化学纯，磨碎混匀；NaOH：40%水溶液，化学纯；硼酸：2%水溶液，化学纯；混合指示剂；0.1moL/LHCL标准溶液；0.02moL/LHCL标准溶液；蔗糖：分析纯；硫酸铵：分析纯，干燥；硼酸吸收液。2.1.3仪器实验用样品粉碎机或研钵；40目分析筛；分析天平；消煮炉或电炉；酸式滴定管；凯氏蒸馏装置；凯氏定氮装置。2.1.4操作步骤2.1.4.1试样的消化称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg），准确至0.0002g，小心无损的将样本放入100mL洗净烘干的凯氏烧瓶中。加入6.4混合催化剂与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和两粒玻璃珠。将凯氏烧瓶置于通风厨里的电炉上加热，开始加热时，先用小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力，消化时经常转动消化瓶，使全部样本浸入硫酸内，如有黑色油在瓶壁，应待烧瓶冷却后加少量蒸馏水冲洗，再继续加热消化。如有黑炭粒不能全部消化，则待烧瓶冷却后，补加少量硫酸加热，直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热至消化完毕。2.1.4.2氨的蒸馏试样消煮液冷却后加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶内，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴、硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，以防漏气。蒸馏4min后降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。2.1.4.3空白测定称取蔗糖0.5g，代替试样，按照前面的消化蒸馏方法进行空白测定，消耗0.1moL/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2mL，消耗0.2moL/L的盐酸标准溶液不得超过0.3mL。2.1.4.4滴定蒸馏后的吸收液立即用0.1moL/L或0.2moL/L标准盐酸溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色。同样滴定试剂空白消化液。2.1.5结果计算粗蛋白质含量（%）=（V一V0）×N×0.014×6.25×100／[M×(V2／V1)]式中：V—滴定样品吸收液时所消耗的盐酸标准溶液体积（mL）；V0—空白测定吸收液所消耗的盐酸标准溶液体积（mL）；V1—样品消化液总的体积（mL）；V2—从100mL消化分解液中吸取的消化液体积（mL）；0.014—氮的毫克当量数；M—样品的质量（g）；N—盐酸标准溶液当量浓度2.2凯氏定氮仪法2.2.1试剂同凯氏定氮测粗蛋白。2.2.2仪器自动或半自动定氮仪。2.2.3操作步骤2.2.3.1试样的消化称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg），准确至0.0002g，放入消化管中，加两片消化片（仪器自备）或6.4g混合指示剂，12mL硫酸，于420℃在消煮炉上消化1h，取出放凉后加入30mL蒸馏水。2.2.3.2氨的蒸馏采用定氮仪，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入两滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以流出的液体呈中性为宜，可用pH试纸测试。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。2.2.3.3滴定、空白测定、计算同国标法。2.3强碱直接蒸馏法2.3.1原理强碱直接蒸馏法(DirectDistillation俗称DD法)是间接测定饲料中粗蛋白质的一种简便的方法。其原理是将粉碎的饲料样品在强碱中消煮，使饲料中的α一氨基、酰氨基以及某些特殊基团上的氮素在强碱的作用下以氨的形式释放出来，直接蒸馏到硼酸中，再用盐酸溶液来滴定，根据盐酸消耗量来计算出DD法所测得的表观含氮量。但是，由于DD法测定过程中的氨量的释放是不定量进行的，因此必须根据经典的凯氏定氮法所标定的校正数值，用一定的回归方程来计算样品中的粗蛋白质的含量。2.3.2试验步骤2.3.2.1消化称量5.000g样品，粉碎经40目筛后放500mL凯氏烧瓶中，加50mL蒸馏水（边加边摇），使充分混合。2.3.2.2蒸馏向凯氏烧瓶中加入25mL10%氯化钡溶液，振荡摇匀，再加120mL40%的氢氧化钠溶液，立即连接蒸馏装置进行蒸馏。把蒸馏装置冷凝管的末端浸入盛有50mL2%的硼酸溶液和2滴混合指示剂的锥形瓶中，轻轻摇动凯氏烧瓶使溶液混匀，然后加热进行蒸馏，待蒸馏出的液体体积达到100mL（总体积达到150mL）时，停止蒸馏。2.3.2.3滴定用0.1moL/L的盐酸标准溶液进行滴定。2.3.3结果计算粗蛋白质含量（%）=（V2－V1）×C×0.014×6.25×100／M式中：V2—滴定试样时所需标准酸溶液的体积（mL）；V1—滴定空白时所需标准酸溶液体积（mL）；C—盐酸标准溶液浓度（moL/L）；M—试样质量（g）；0.014—与1.00mL盐酸标准溶液[C(HCL)=1.000moL/L]相当的、以g表示氮的质量；样品中含氮量用以下的回归方程计算：y=9.2918x一0.2852式中：x—为DD法测定所得到的含氮量；y—为样品的实际含氮量。2.4双氧水法测定2.4.1试剂硫酸（GB625）：化学纯，含量为98%，无氮；双氧水：分析纯，含量为30%；氢氧化钠（GB629）：化学纯，40%水溶液（m/v）；硼酸（GB628）：化学纯，2%水溶液（m/v）；混合指示剂；盐酸标准溶液；邻苯二甲酸氢钾法标定液按GB601制备；C（HCL）=0.1moL/L、8.3mL盐酸（GB622-分析纯）注入1000mL蒸馏水中；蔗糖（HG3-1001）：分析纯；硫酸铵（GB1396）：分析纯，干燥。2.4.2仪器实验室用样品粉碎机或研钵、分样筛孔径0.45mm（40目）、分析天平（感量0.0001g）、消煮炉或电炉、滴定管（酸式，10mL、25mL）、250mL消化管、150mL、250mL锥形瓶、定氮仪（以凯氏原理制造的各类型半自动蛋白质测定仪）。2.4.3原理浓硫酸和30%浓度的双氧水都是强氧化剂。饲料中的有机物接触到浓硫酸便被脱水炭化。但是在高温条件下，向未被硫酸完全氧化的饲料中滴加30%的双氧水，会使饲料中的有机物彻底氧化、分解，放出CO2、SO2，而释放出的氨气则和硫酸结合生成硫酸铵。然后用半微量凯氏定氮装置对接收液进行蒸馏，再用盐酸标准溶液对接收液进行滴定，根据盐酸消耗量计算出饲料中的粗蛋白质的含量。2.4.4试验步骤2.4.4.1样品消化样品粉碎后全部通过40目。称取试样0.2～2.0g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入消化管中，加浓硫酸10mL摇匀，管口上放一只小漏斗（在消化过程中起回流作用，以减少硫酸的损失），放在电炉上消煮20min，当硫酸大量冒烟、消化液呈酱油色时，将消化管取下稍冷却（手摸不烫手），向管内加双氧水10～15滴，加热消化。如此反复2～3次，直至管内溶液澄清透明为止。取下消化管，冷却后注入30mL蒸馏水备用。2.4.4.2氨的蒸馏采用定氮仪，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入两滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以流出的液体呈中性为宜，可用pH试纸测试。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。2.4.4.3滴定用0.1moL/L的标准盐酸滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。记录好盐酸的用量，然后计算出饲料中的粗蛋白质的含量。2.4.4.3空白测定同国标法。2.4.5结果计算计算方法同国标法。3试验结果及分析3.1凯氏定氮仪法与国标法测粗蛋白测定结果的比较及结论（见表1）3.1.1比较表1凯氏定氮仪法与国标法测定结果的比较项目国标法凯氏定氮仪法鱼粉玉米蛋白豆粕鱼粉玉米蛋白豆粕测定值（％）62.5041.0841.7662.2341.0641.8561.9441.2041.0261.9741.1541.0663.1740.8641.2063.1541.2041.1563.2340.9841.3062.9841.9841.2060.2741.4541.2560.8240.9941.3562.8541.2041.7061.6841.1540.8862.9941.1240.9862.6041.0542.3062.7640.9442.2063.2540.8741.88平均值（％）62.4641.1041.4262.3741.0741.46总计499.71328.83331.41498.98328.55331.67标准差1.220.631.120.380.330.36变异系数0.0190.0150.0270.0060.0080.0093.1.2结论3.1.2.1精密度的比较两种方法的8次平行测粗蛋白含量结果见表1。试验结果表明采用定氮仪分析法测定密度优于国标法，相对标准偏差较小。3.1.2.2两种消化系统的比较从表2可以看出，对于同一样品和称样量，模块式消化系统在消化中损失的酸少，且采用模块式消化系统DS－4可以一次性消化4个样品，大大提高了工作效率。表2两种消化