与乳酸菌具有共生作用酵母菌培养基的优化

与乳酸菌具有共生作用酵母菌培养基的优化摘要：以对乳酸菌（LC5）有促进作用的酵母菌（YE4）为研究对象，OD值和活菌数为测定指标，筛选合适的培养基。通过对5种酵母菌常用培养基的初筛及二次筛选，确定在YPD培养基中YE4生长良好。以YPD培养基作为基础培养基，进一步利用单因素试验和正交试验的设计方法对其进行优化，得出改良YPD培养基的最佳成分是大豆蛋白胨为0.4%，胰蛋白胨为0.4%，酵母浸提粉为0.4%，蔗糖为1.2%，蒸馏水为100mL。改良YPD培养基活菌计数测得的活菌数可达到5.01×108CFU/mL，比YPD基础培养基高一个数量级；OD值是YPD基础培养基的1.06倍。关键词：酵母菌；培养基；优化OptimizationMediumofYeastYE4HavingSymbioticFunctionwithLacticAcidBacteriaLC5Abstract：Yeast（YE4）istakenasresearchobject，whichcanpromotetheroleoflacticacidbacteria（LC5），andOD600andviablecountareasdeterminationofindicatorstofiltersuitablemediumofYE4.Byselectingfrom5mediumswhichtheYE4usuallyused，theresultshowsthattheYE4growsverywellinYPDmedium.SoYPDisselectedasthebasemedium，byusingsinglefactorexperimentandorthogonaltestdesignmethodtooptimizeit，andthebestingredientsofthemodifiedYPDarethat：soypeptone0.4%，tryptone0.4%，yeastextractpowder0.4%，sucrose1.2%anddistilledwater100mL.TheviablecountofYE4withmodifiedYPDcanreach5.01×108CFU/mL，whichismorethanbasismediumoneorderofmagnitude，also，theODvalueis1.06timesthanthebasisYPDmedium.Keywords：yeast（YE4）；medium；optimization酵母菌是一种单细胞真核微生物[1]，是子囊菌、担子菌等单细胞真菌的通称。多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如植物的叶子）[2]。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5μm或5~20μm。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌的生殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两大类，其在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌。在有氧的情况下，它把糖分解成CO2和水，且生长较快；在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和CO2。在现代工业中除了用于酿酒外，还用于甘油、食用酵母、有机酸、酶制剂、石油脱蜡，以及饲料等的生产[3]。酵母菌一般还能利用无机氮源或尿素来合成蛋白质，已经成为目前最重要的单细胞蛋白来源[4]。在传统发酵乳制品中，乳酸菌与酵母菌作为益生菌对产品的发酵过程发挥着主导作用。因此，乳酸菌与酵母菌作为对人体有益的微生物，它们有着相似的生长条件和营养需求，即共生基础。例如，它们都能很好地利用糖来进行糖发酵。有研究表明酵母泥中的大分子物质通过乙醇提取后，添加在合成培养基上，可以缩短乳酸菌的迟滞期，增加乳酸菌的数量，原因可能是酵母大分子物质能诱导乳酸菌中氨基肽酶的合成，使氨基酸及小分子缩氨酸含量增加，从而促进乳酸菌的生长；另外酒精发酵或酵母自溶产生的吡喃甘露糖可以吸收中链脂肪酸，解除其对乳酸菌的毒害作用，还可能增加乳酸菌的α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰基β-表1L9（34）正交试验因素与水平设计葡萄糖脱水酶及肽酶的活性，使培养基的营养丰富，间接地促进乳酸菌的生长[5]。GobbettiM等人[6]在MRS培养基中，通过添加4种不同碳源（麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖）来研究2株酵母菌与2株乳酸菌之间的相互作用。结果显示，在添加了蔗糖的MRS培养基中双菌培养的乳酸菌活菌数明显高于单菌培养的活菌数，笔者通过蔗糖分解的动力学曲线分析其原因是酵母菌可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖，为乳酸菌提供稳定的碳源。此外，有些酿酒酵母的生理特性（蛋白酶活性、大分子物质生成）及自溶量等，都可能对乳酸菌的生长及苹果酸-乳酸发酵起促进作用，因此添加酵母提取物对乳酸菌的生长和代谢活性有一定的促进作用[7]，但关于这方面研究的资料很少。刘敏敏等人[8]对内蒙古锡盟地区酸马奶中分离出的8株乳酸菌和7株酵母菌，进行潜在共生菌的筛选。在各自培养基中交互添加代谢物作为试验组，以各自培养基中添加等量生理盐水作为对照，分析比较稳定期的浊度值，结果发现乳酸菌LC5和酵母菌YE4在脱脂乳培养基中共同培养和2者在各自培养基中交互添加代谢物培养，都表明其具有相互促进作用。基于刘敏敏等人的试验，本试验对5种酵母菌常用培养基进行初筛及二次筛选，确定1种作为基础培养基。对该基础培养基进行优化，使培养基的营养条件更有利于酵母菌YE4的生长，为进一步研究对乳酸菌具有促生作用的酵母菌代谢产物的分离纯化奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种酵母菌YE4是从内蒙古锡盟地区酸马奶中分离而来、且与酸马奶中的1株乳酸菌有明显促进作用的酵母菌，由内蒙古农业大学“内蒙古传统发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌互生机理的研究”课题组提供。1.1.2培养基YPD培养基[9]、豆芽汁培养基[10]、麦氏培养基[11]、LB培养基[12]、马铃薯培养基[13]。1.1.3试验仪器SKP-01型电热恒温培养箱，湖北省黄合恒丰医疗器械有限公司产品；PL303型电子天平，塞多利斯科学仪器（北京）产品；2004（C）T6型新悦可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；SK-1型快速混匀器，常州国华电器有限公司产品；HIRAYAMA型立式高压蒸汽灭菌锅，华粤企业集团有限公司产品；BCN-1360型微生物洁净工作台，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司产品。1.2试验方法1.2.1菌种的活化将YE4酵母菌冻干粉用接菌环接到YPD液体培养基中，30℃恒温培养30h，活化2代后以3%接种量分别接种于相应的培养基中，30℃培养30h后测定菌体生长情况。1.2.2基础培养基筛选（1）基础培养基的初筛。以活菌计数、OD值以及pH值为测定指标，对马铃薯、豆芽汁、YPD、LB与麦氏5种常用的酵母菌培养基进行筛选，选出3种生长情况较好的培养基进行二次筛选。（2）基础培养基的二次筛选。对初筛得出的3种培养基进行二次筛选，测定指标同上，确定1种作为基础培养基。1.2.3基础培养基的优化（1）基础培养基主要成分的单因素试验。在其他成分不变的情况下，分别采用各种不同的碳源、氮源及生长因子取代基础培养基中相应成分，配制培养基，接种培养，依据OD值确定碳源、氮源及生长因子的成分，接种量为3%，30℃培养30h，以YPD基础培养基为对照。（2）基础培养基主要成分使用量的单因素试验。在单因素试验对YPD基础培养基的碳源、氮源以及生长因子成分确定的基础上，对培养基中各种营养成分的使用量进行确定，当改变某一种成分使用量时培养基中其他成分的使用量均不改变。培养条件同上。（3）基础培养基主要营养因素的正交试验。在单因素试验的基础上，以最佳使用量为基准，上下波动一定范围为选择依据，对基础培养基的成分进行L9（34）正交试验设计，对其营养成分进行优化。L9（34）正交试验因素与水平设计见表1。1.2.4改良YPD培养基与YPD培养基对比试验在确定了改良YPD培养基的配方后，将改良YPD与YPD通过OD值、活菌数和pH值指标进行对比，评价改良YPD培养基的改良效果。1.2.5测定指标（1）OD值。发酵培养液直接用可见光分光光度计测定，其在波长600nm处的光密度（OD600）。（2）活菌计数。采用倍比稀释法，每样做3个稀释度，每个稀释度做2个重复，酵母菌在30℃温箱培养30h。取菌落数为30~300个的平板计数，取水平A大豆蛋白胨+胰蛋白胨B酵母粉C蔗糖1230.4+0.40.5+0.50.6+0.60.40.50.60.81.01.2/%·6·2013年第10期平均值，结果用每1mL发酵液的菌落数表示。（3）pH值。采用SartorivtsPB-10pH计测定，记录数据。2结果与分析2.1基础培养基的筛选2.1.1基础培养基的初筛以活菌数和OD值为测定指标，对马铃薯、豆芽汁、YPD、LB与麦氏5种常用的酵母菌培养基进行筛选。不同培养基中酵母菌YE4的OD值、pH值和活菌数见表2。由表2可知，比较5种培养基的活菌数，YPD最高，其活菌数为3.68×107CFU/mL，其次为马铃薯培养基；活菌数最低的是豆芽汁培养基，活菌数只有6.43×106CFU/mL；对数值比YPD低0.75。对于5种培养基的OD值，YPD培养基明显优于其他培养基，为1.756±0.009。考虑到pH值对培养基的影响，豆芽汁培养基的pH值最低为3.31，可见该培养基中的酸度太高，反而会抑制酵母菌的生长，使得其活菌数较少。考虑到本试验以提高培养基中的活菌数和OD值为目的，因此选择马铃薯、YPD及LB培养基进行二次筛选，以确定是酵母菌YE4生长的最近培养基。2.1.2基础培养基的二次筛选继续用初步筛选出的YPD、马铃薯、LB3种培养基培养酵母菌，活化3代后进行活菌计数。不同培养基中酵母菌YE4的OD值、pH值和活菌数见表3。由表3可知，比较3种培养基的活菌数，YPD的最高，其活菌数为4.38×107CFU/mL，其次为马铃薯培养基；活菌数最低的是LB培养基，活菌数只有2.11×107CFU/mL；比YPD低2.27×107CFU/mL。对于3种培养基的OD值，YPD培养基明显优于其他培养基，为1.796±0.005，且pH值接近与酵母菌生长的最佳pH值。因此，选择YPD为酵母菌YE4生长的基础培养基，并对其营养成分进行进一步的优化。2.2基础培养基中主要营养成分的单因素试验2.2.1碳源以YPD基础培养基为对照，不改变其他系统的成分和用量，用乳糖等糖类作为碳源代替葡萄糖。接种量为3%，30℃培养30h，测定菌体的OD值。碳源对酵母菌YE4菌体OD值的影响见图1。从图1可以看出，用葡萄糖及乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖4种碳源与YPD基础培养基中的葡萄糖进行对比时，当蔗糖作为碳源时菌体密度显著高于另外3种碳源，OD值高达1.932，比单糖葡萄糖的OD值高0.108。因此，选择蔗糖作为最佳碳源。2.2.2氮源以YPD基础培养基为对照，不改变其他系统的成分和用量，只改变氮源中蛋白胨的成分，以胰蛋白胨等蛋白胨类产品代替蛋白胨。培养条件同上。氮源对酵母菌YE4菌体OD值的影响见图2。由图2可以看出，酵母菌YE4对大豆蛋白胨和胰蛋白胨的利用需求显著高于对其他组的利用，OD值达到1.823，是YPD基础培养基的1.10倍。胰蛋白胨是一种动物蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成，含有丰富的氮源、氨基酸等；大豆蛋白胨是一种植物蛋白胨，其营养丰富，主要成分为低分子肽和氨基酸，有利于酵母菌的生长、繁殖。因此，选用大豆蛋白胨和胰蛋白胨作为培养基的主要氮源。2.2.3生长因子以YPD基础培养基为对照，不改变其他系统的成分和用量，以牛肉膏等生长因子代替酵母浸提粉。图2氮源对酵母菌YE4菌体OD值的影响表2不同培养基中酵母菌YE4的OD值、pH值和活菌数培养基OD值pH值活菌数/CFU·mL-1马铃薯豆芽汁YPDLB麦氏1.645±0.0150.967±0.0111.756±0.0091.643±0.0070.603±0.0133.633.314.963.