一种易用的采用自清洁API离子源的生物柴油分析方法

ApplicationNote:389_CKeyWords•Accela™•MSQPlus™•HypersilGOLD™column•ASTMD6751一种易用的采用自清洁API离子源的生物柴油分析方法JenniferHuang1,RayChen1,DanielaCavagnino2,andEdLong1,1ThermoFisherScientific,SanJose,CA,USA;2ThermoFisherScientific,Milan,Italy实验目标：开发一种高效易用的LC/MS生物柴油分析方法作为现存方法ASTM6751和EN14331的补充。方法：一种二元梯度反相高速液相色谱结合质谱检测器和光电二极管阵列检测器的生物柴油样品分析法。实验结果：使用高速LC/MS系统首次分离检测生物柴油样品。采用锥清洗来预防接口污染和堵塞。前言生物柴油是用植物油甘油三酸酯与甲醇合成脂肪酸甲酯(FAMEs)时脂交换的产物。该合成的副产品，包括甘油、酰基甘油、甘油二酯、未反应的甘油三酸酯和脂肪酸，会引起发动机故障。为预防此发动机问题，美国材料实验协会(ASTM)规范D6751规定，在美国出售的生物柴油燃料中，甘油含量必须小于0.25%。该规范建立了第一个生物柴油产品纯度标准，是生物柴油工业的里程碑。为与ASTMD6751规范及未来可能出现的混合生物柴油的新规章保持一致性，有必要开发一种检测甘油含量的灵敏可靠的分析方法。ASTMD6584和EN14105规定的方法是采用火焰离子化检测器(FID)的气相色谱法(GC)。然而，用气相色谱分析高沸点甘油三酸酯，为避免样品歧视和/或降解，需要准确的选择进样器、色谱柱和整体操作条件。一般而言，LC/MS适用于非挥发性组分分析，但是因为传统LC/MS接口易被复杂肮脏样品基体污染，该分析方式在一般实验室中没有得到普及。如果缺少严格的样品制备，由于LC/MS接口累积的粘性残留物，造成质谱仪的污染和堵塞。本文中，我们论证了一种简单高效的LC/MS生物柴油分析方法。该方法或者可以作为EN14331的替代方法，或者用其检测结果作为EN14331所得数据的补充。相比于GC方法所需的45min，该高速LC/MS体系仅需要20min就可完成分析检测。LC/MS设备扩展的质量检测范围，结合进样、分离和化合物离子化的能力，所得数据完全符合ASTM规定的要求。集成于质谱电喷雾源的锥清洗专利技术保证了复杂基体样品的无中断分析检测。本文所述的方法可以用于大范围的石油和石化分析中的化合物表征。材料和方法仪器使用ThermoScientific生产的Accela高速液相色谱和MSQPlus质谱检测器。Accela高速液相色谱系统包括低延迟四元泵、全温控自动进样器和光电二极管检测器（PDA）。MSQPlus质谱是带有电喷雾离子源(ESI)接口的四极杆质谱仪。该高速LC/MS系统可耐15,000psi高压，易于色谱参数的灵活设置。图1是该系统的图示。集成的锥清洗喷嘴用持续的80μL/min的甲醇流冲洗截取锥（见图2），用以清除进口锥上可能产生的沉积和堵塞。样品和标准品直接输注，用于仪器调谐和质谱参数优化。图1：ThermoScientific生产的Accela高速液相色谱系统（可耐15,000psi高压）和MSQPlus单四极杆质谱仪样品制备三癸酸甘油酯和甘油一油酸酯购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，分别用甲醇溶解配制成浓度为10mg/mL的溶液。再分别用甲醇（含10mMLiI)进一步稀释为浓度图2：生物柴油分析中，锥清洗喷嘴位于进口锥入口孔处。冲洗溶剂的选择参照样品和流动相，本实验采用甲醇清洗。Column:100×2.1mm,1.9µmHypersilGOLDColumnoventemperature:45ºCSolvents:A:Waterwith0.1%formicacid,0.02%TFAB:Methanolwith0.1%formicacid,0.02%TFATimeAB0.0703014.0010020.0010020.1208022.02080Flowrate:0.55mL/minInjectionvolume:10µLSampleamount:10µgESIprobtemp:400ºCConevoltage:50V为0.010、0.050、0.1、2.5和5mg/mL的三癸酸甘油酯系列溶液和浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5和5mg/mL的甘油一油酸酯系列溶液。生物柴油样品来自ThermoFisherScientific（Milan,Italy），样品先用甲醇稀释为100mg/mL的溶液，再用10mM碘化锂甲醇溶液进一步稀释浓度为1mg/mL的溶液。结果高低分子量组分的分离本实验检测了混合在冬用柴油里5%的生物柴油(BD3)。采用表1中的检测条件，在20min内对样品表1：高效液相系统流动相、梯度、色谱柱和MSQPlus单四极杆质谱检测器参数设置进行了完全分离（见图3A）。如质谱图3B所示，样品中有很多低分子量(MW)组分，也有很多高分子量组分。实际上，低分子量组分出现在图谱的第一部分（13min前），高分子量组分在出现在第二部分（13min以后）。在本次分离中，质谱检测器检测该生物柴油样品的灵敏度比PDA检测器高。PDA仅仅在205nm检出3个可辨认的紫外峰，而MSQPlus总离子流色谱（TIC）则多检出15个峰。他们代表了生物柴油中主要的FAMEs成分。两种检测方法的灵敏度差别在后文中线性动态范围研究中进一步讨论。因为高分子量组分浓度高，并得到很好的分离（见TIC图3A和全质谱图3B），鉴定起来相对简单。图4A中，用SIC（选择离子色谱）进一步对分离进行了确定。这些组分的结构研究将作为生物柴油分析中进一步研究的重点。小分子在分离中首先被淋洗下来。色谱图中有可以辨认的20多种不同的组分（见图5）。图5B-5K从中选择了9个峰的质谱图。其中有些组分被很好的单独分离出来，有些则一个峰中存在多个组分，这说明分离方法还需要进一步进行调整。图3：(A)BD3在205nm的吸收光谱图和基峰谱(BPC)；(B)图3A中BPC的全质谱图，显示出低质量范围内复杂的低分子量化合物组分和高质量范围内相对清楚的高分子量组分线性动态范围完成了生物柴油样品线性动态范围的初步工作。校准物之一的甘油一油酸酯在PDA和MSQPlus检测中均有线性表现。PDA检测线性动态范围为500ng-25ug，MSQPlus检测线性动态范围较低，为5ng-500ng(见图6A和6B)。图4：(A)图3A中BPC后半部分的高分子化合物；(B)-(H)每个组分的SIC图谱。SIC单峰说明高分子量组分（可能来源于冬用柴油）被单独分离出来。图5：生物柴油样品BD3的化学组分非常复杂。图5A显示了这些组分的分离，其分离条件需要进一步优化。然而，(B)-(J)的质谱图中则显示出生物柴油中主要成分FAMEs的特征分子量。例如m/z299.33来自C18:0；m/z297.43(J)来自C18:1；m/z295.36(I)来自C18:2；m/z293.41(H)来自C18:3；其他峰则代表了其他的FAMEs，大约500~600m/z的更高分子量的组分来自甘油脂。这些组分的鉴定将成为该样品研究的进一步的工作。锥清洗特点上述结果如果没有锥清洗（特别用于MSQPlus质谱仪）是无法得到的，因为该功能除去了任何可能沉积在MSQPlus进口锥上的残留物，避免了堵塞。图7是拍摄于所有实验完成之后的进口锥图。结论高速LC/MS系统检测生物柴油样品的初步研究表明，LC/MS方法不仅将分析时间缩短至20min，而且还揭示了生物石油中高分子量组分的信息，同时对包括FAMEs组分在内的低分子量化合物的检测表现出高灵敏度。锥清洗保持了接口清洁，使其免于复杂的生物柴油样品的污染和堵塞。下一步研究将着重于两个方面：1)调整分离条件，进一步分离先洗脱的低分子量组分；2)鉴定和定量TICs图中的各组分。参考文献•“CharacterizationofbiodieselandfinishedbiodieselblendsbyconventionalGCandcomprehensive2DGC.”DanielaCavagnino,GiacintoZilioli,FaustoMunari.102ndGulfCoastConference,Galveston,TX.Oct.17-18,2006.•QuantitationoftriacylglycerolsinplantoilsusingHPLCwithAPCI-MS,evaportativelight-scattering,andUVdetection.MichalHolcapek,MiroslavLisa,PavelJandera,NadezdaKabatova.J.Sep.Sci.2005,28,1315-1333.图6：校准物之一的甘油一油酸酯在PDA(A)和MSQPlus(B)检测中的线性动态范围。正如我们在图3中所知，MSQPlus在生物柴油的检测中比PDA表现出更高的灵敏度。其定量和校准数据将会在以后的报告中给出。Page4of8图7：经过几个星期生物柴油分析后的MSQPlus质谱仪的进口锥C/MSapplicationnotesat: